Aβ引起神经干细胞衰老及降低烟碱类似物ZY-1治疗的反应性

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理特征是:细胞内外β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)的沉积和细胞内tau蛋白的高度磷酸化以及神经元的丢失。成年海马神经再生障碍与AD记忆力下降有着密切的关系。目前，用于AD治疗的胆碱酯酶抑制剂和非竞争性NMDA受体抑制剂临床疗效不佳。因此，新型药物研发需要考虑其对AD成年海马神经再生的影响。
　　已经取得专利的烟碱类似物ZY-1对α4β2亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nic=tinic acetylcholine receptor, nAChR)具有高度的亲和力，前期研究表明，该化合物能够抑制体外特定转染α4β2 nAChR细胞产生的Aβ，并且显著改善9月龄APP/PS1转基因AD模型小鼠的空间学习记忆能力。为了进一步探讨ZY-1是否具有可以作为AD治疗药物研发的潜力，我们应用细胞生物学和分子生物学等方法，研究ZY-1对成年小鼠海马神经再生的影响，并分析其可能的机制。
　　体外成功分离、培养成年小鼠海马神经干细胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)。不同浓度的ZY-1处理NSPCs7天后，CCK8实验检测ZY-1对NSPCs活力的影响，结果表明，ZY-1在0.1～5μM范围内明显增加了细胞活力，并且在1μM浓度下达到最大效应，此效应可被α4β2 nAChR拮抗剂DHβE所抑制。神经球增殖实验检测ZY-1对NSPCs增殖的影响，结果显示，ZY-1增加了神经球的数目和神经球的大小，表明ZY-1促进了NSPCs的增殖能力。划痕损伤实验和Transwell迁移实验检测ZY-1对NSPCs迁移能力的影响，结果均显示，ZY-1明显促进NSPCs的迁移能力。细胞免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹实验检测ZY-1对NSPCs分化能力的影响，结果表明，ZY-1对NSPCs向神经元或星形胶质细胞的分化能力均无影响。对其机制的探索，发现在NSPCs增殖期间ZY-1明显增加细胞内ROS水平，同时还能抑制Aβ42诱导的细胞内ROS水平。这些结果说明，在体外，ZY-1通过调节细胞内ROS水平促进成年海马神经再生。
　　前期体内实验表明，对APP/PS1转基因AD模型小鼠的Aβ沉积和神经元受损等病理特征，ZY-1疗效不佳。在此基础上，我们用β-Ⅲ-tubulin标记新生的神经元，免疫荧光实验观察到，AD小鼠脑内海马齿状回(dentategyrus，DG)区新生神经元数目明显减少，但是ZY-1对这种新生神经元的减少的现象也无明显改善作用。
　　为了分析ZY-1改善AD脑内神经再生障碍失败的原因，我们又进一步研究了AD脑内局部不良微环境对NSPCs的影响，并探索其可能的作用机制。
　　寡聚体Aβ42(2.5μM～10μM)处理NSPCs1天、3天和5天后，CCK-8实验表明，Aβ42呈浓度依赖性和时间依赖性的抑制细胞活力，并且Aβ42处理的神经球数目和大小也明显减少。在细胞形态方面，无论悬浮培养还是单层贴壁培养的Aβ42处理的NSPCs均显示了细胞衰老的形态。细胞免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹实验均显示，Aβ42明显抑制了NSPCs向神经元和星形胶质细胞的分化能力。此外，Aβ42还增加了NSPCs中细胞衰老的数目以及与衰老有关的p16蛋白的表达，并降低其下游分子Rb蛋白的磷酸化水平。这些结果均表明，Aβ42加速了NSPCs的衰老。
　　体内实验显示，与野生型相比，Aβ特异性的存在于APP/PS1转基因小鼠的皮质和海马中。在APP/PS1转基因小鼠海马DG区中，随着Aβ的逐渐沉积，NSPCs数目明显减少，至18月龄几乎消失;与同龄野生型相比，9月龄APP/PS1转基因小鼠海马DG区衰老的NSPCs数目明显增加，同时，用酶联免疫吸附实验检测衰老细胞分泌的蛋白，发现转基因小鼠海马组织中分泌的细胞因子IL-6明显增加，IGF-1水平降低。这些体内实验进一步表明，Aβ与NSPCs的衰老有关。
　　为了明确Aβ42诱导NSPCs衰老的机制，我们发现小鼠海马DG区以及体外培养的NSPCs中均存在Aβ42功能性甲酰肽受体2(formylpeptidereceptor2，FPR2)的表达。Aβ42诱导NSPCs中FPR2蛋白表达增高，其抑制剂WRW4能显著改善Aβ42诱导的NSPCs衰老表型。此外，Aβ42还增加了细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及p38蛋白的磷酸化水平，WRW4、抗氧化剂NAC或p38 MAPK抑制剂SB203580均抑制了Aβ42诱导的氧应激及NSPCs的衰老。这些结果表明，Aβ42通过功能性FPR2受体及其下游ROS-p38 MAPK信号通路加速了NSPCs的衰老。
　　综上所述，ZY-1在体外通过调控细胞内ROS水平促进成年海马神经再生，然而，对APP/PS1转基因小鼠AD模型的病理特征和神经再生障碍均无改善作用。对其原因分析，我们发现AD模型小鼠海马中Aβ的存在通过功能性FPR2受体及其下游ROS-p38 MAPK信号通路加速了NSPCs的衰老，限制了NSPCs的功能，并最终导致神经再生障碍。
　　这些结果提示，神经再生对脑内局部不良微环境更为敏感，在神经再生失败的基础上刺激NSPCs增殖，疗效不佳，并可能影响药物改善学习记忆长期疗效的稳定性。治疗AD的药物研发应考虑脑内局部不良微环境对神经再生的影响。

目录

声明

摘要

前言

1．1 阿尔茨海默病

1．2 AD药物研发的新进展

1．3 成年神经再生

1．4 AD脑中的成年神经再生

1．5 影响成年神经再生的因素

1．6 目前临床治疗AD的药物与神经再生的关系

1．7 本研究内容和意义

材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要药品和试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试药与试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 成年小鼠海马NSPCs培养

2．2．2 寡聚体Aβ42制备

2．2．3 NSPCs活力、增殖、迁移和分化的检测

2．2．4 病理学检测

2．2．5 老化指标检测

2．2．6 蛋白质免疫印迹实验(western blot)检测各蛋白的表达水平

2．2．7 统计学分析

结果

3．1 成年小鼠海马NSPCs的培养

3．2 烟碱类似物ZY-1对成年海马神经再生的影响

3．3 Aβ42对成年海马NSPCs的影响及机制研究

讨论

4．1 成年小鼠海马NSPCs的培养

4．2 烟碱类似物ZY-1对成年海马神经再生的影响

4．3 Aβ42对成年海马NSPCs的影响及机制研究

全文总结

5．1 主要结果

5．2 本实验的创新点

5．3 研究展望

参考文献

缩写词表

攻读博士学位期间参与的科研项目

攻读博士学位期间已发表或录用的论文和获奖情况

致谢