厌氧甲烷氧化微生物代谢分子机制及其潜在参与矿物形成机理的研究

摘要

微生物主导的厌氧甲烷氧化作用（AOM, anaerobic oxidation of methane）对全球气候、海洋地质地貌以及生态系统具有重要的影响。每年有4×108吨甲烷通过AOM消耗，相当于全球海洋甲烷年产量的85％，这是海洋碳循环中的重要组成，因此AOM直接影响着全球的气候变化；AOM会促进环境中碳酸盐矿物的形成，参与海底地质地貌的改变；AOM还能够将甲烷转变成其它异养生物能利用的有机质，为生态系统提供碳源和能量。在当今全球气候变暖的背景下研究参与和影响甲烷生物地球化学循环的分子机制和环境调控因子，将为合理开发、利用环境资源和保护地球生态环境提供科学基础和理论依据。
　　厌氧甲烷氧化古菌（ANME-1、-2、-3）是目前已知的进行AOM的微生物类群，在环境中它们通常和硫酸盐还原菌（SRB）或其它细菌形成2-20微米的细胞团，由于ANME和细胞团中其他的细菌都不能在实验室环境下进行纯培养，人们无法采用传统的微生物学研究方法研究此类微生物。在本研究开展之前，应用宏基因组手段获得的ANME基因组覆盖率只有20%左右，SRB和细胞团中其它微生物的基因组信息则更少。这极大地限制了人们对细胞团中不同微生物代谢功能以及微生物之间的相互关系的理解和认识。
　　在本研究的前期工作中我们获得了一个甲烷厌氧氧化和硫酸盐还原活性很高的富集培养物，其主要的微生物组成是ANME-2a和SRB。在此基础上我们创新性地将单细胞显微操作分选、全基因组扩增以及高通量测序手段应用于富集物中ANME形成的单个细胞团。经过大量的分选我们获得了10个包含有ANME-2a的细胞团基因组，包括一个仅由古菌ANME-2a构成的细胞团。这些细胞团的古菌组成都是ANME-2a，其16S rRNA基因的相似度在99.4%以上，而细菌的组成多样性丰富：除了已经报道的Delta变形菌中的SRB以外，还有Beta变形菌中的Limnobacter、Gamma变形菌中的Acinetobacter以及未分类细菌类群OP1和Acidobacter。我们对其中6个具有代表性的细胞团进行了高通量测序和序列组装分析，其中对一个单纯由ANME-2a古菌构成的单个细胞团基因组的组装和分析让我们得到一个覆盖率约为90%的ANME-2a基因组。这个ANME-2a基因组中包含有一套经典的完整七步甲烷产生途径所需的基因，并且转录组分析显示这些基因都是活跃表达的，这其中包括了先前报道在ANME-1中缺失的参与甲基和亚甲基氧化还原反应的mer基因。与甲烷产生途径不同的是ANME-2a的基因组中包含两套编码四氢甲烷蝶呤S-甲基转移酶（Mtr）和两套编码Mer蛋白的基因，这是第一次在甲烷代谢古菌（包括甲烷产生菌）中发现同时存在两套mtr和mer基因。这两套基因在甲烷氧化代谢反应中都转录表达，但其中一套呈现更高的表达水平，它们是否在ANME-2a的代谢反应中催化了不同的生物化学反应还有待进一步深入的研究。我们的工作支持了前人关于ANME氧化甲烷可能采用逆向甲烷产生途径的假说，还表明不同的甲烷氧化古菌（ANME-1，ANME-2）采用了不同的甲烷氧化代谢途径。
　　在研究与甲烷相关的能量产生机制方面，我们从ANME-2a基因组中发现了多套缺少氢酶的电子传递和能量转换系统，其中包含F420H2还原酶Fpo、位于细胞质和细胞膜上的辅酶B异硫酸盐还原酶HdrAB和HdrDE、细胞色素C以及红细菌固氮复合物（Rnf）。拥有这类不依赖氢气的电子传递和能量转换系统体现了ANME-2a对海洋环境中氢气容易扩散的适应能力。另外多拷贝的电子传递蛋白Hdr的发现暗示甲烷氧化产生的电子可以流向不同的受体物质。这种复杂而又相互关联的电子传递系统体现了ANME-2a细胞底物利用的多样性和环境变化的适应性。
　　我们还从基因组层面部分解析了与ANME-2a形成共生细胞团的两类细菌的代谢潜能。结果表明SRB是自养型微生物，它通过还原型乙酰辅酶A途径来固定二氧化碳；Limnobacter是化能有机异养型微生物，可通过还原态硫的氧化获取能量，依附在ANME细胞团上可使其获得生长所需的碳源和能源。
　　最后我们还研究了与AOM相关的微生物矿物形成机制。AOM会增加周围环境中的碱度和可溶性无机碳浓度，从而促进碳酸盐矿物的形成。在本研究中我们观察到所有的ANME细胞团都被一层外壳状结构包裹，考虑到微生物的外膜和膜外分泌物在碳酸盐矿形成中的重要作用，这层外壳结构很有可能是ANME参与形成碳酸盐矿物的直接体现。通过纳米次级离子质谱等手段的应用，我们获得了整个富集物中的矿物组成信息以及ANME细胞团表面及内部高分辨率的形态和元素分布图，结果表明碳酸盐的形成并没有和细胞直接接触，而细胞团外壳是由含硅的矿物组成。对于硅质外壳的成因我们推测是AOM形成的碱性环境促进了周围二氧化硅类矿物的溶解，由于细胞表面和周围微环境的特性同大环境存在差异，这些溶解的硅又再次沉积在细胞团周围形成硅质外壳。这一发现首次证实了ANME和硅酸盐矿物的形成有关，并表明ANME在联系海洋碳循环和硅循环中扮演着重要的角色。
　　本文工作围绕AOM过程的分子机制解析来展开，创新性地利用多学科交叉技术手段解析了厌氧甲烷氧化的生物化学反应过程和电子传递途径，证实了参与AOM的共生细菌具有多样性并部分解析了其参与C/N/S循环的代谢潜能，探讨了细胞团中不同微生物之间的关系，并且阐述了AOM介导的矿物生成机制。我们的工作将为理解AOM这一海洋碳循环中关键的生物过程提供了新的认识。

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符号说明

1. 绪论

1.1.微生物厌氧甲烷氧化作用研究进展

1.2.微生物产甲烷作用研究进展

1.3.硫酸盐还原菌研究进展

1.4.微生物和矿物的相互作用

1.5.本研究所涉及到的技术方法综述

1.6.本文的研究意义和目标

2. 材料和方法

2.1.富集物样品描述

2.2.富集培养基的制备

2.3. 探针和引物

2.4.主要仪器

2.5.主要试剂

2.6.试剂盒

2.7.感受态细胞和质粒

2.8.工具软件

2.9.微生物细胞的蛋白质染色

2.10. 微生物细胞的多糖染色

2 . 11 . 微生物细胞的荧光原位杂交（ FISH）

2 . 12 . Percoll(R)不连续密度梯度离心去除富集物样品中的杂质：

2.13. 显微操作法分选单细胞团

2.14. 全基因组 MDA扩增、验证和纯化

2.15. 细胞团微生物组成分析

2.16. 系统进化树构建

2.17. 单细胞团基因组测序、组装和注释

2 . 18 . ANME--2a全基因组覆盖率的计算

2 . 19 . 应用于 nanoSIMS和 SEM的样品制备方法

2.20. 富集物样品的矿物组成分析

3. 结果和讨论

3.1.单个细胞团微生物组成分析

3.2.单细胞团基因组测序结果总览

3.3. ANME-2a的基因组分析

3 . 4 .与 ANME--2a共生的 SRB的功能基因分析

3 . 5 .与ANME--2a共生的一株Beta变形菌Limnobacter spp.的基因组功能分析

3 . 6 . ANME、SRB以及 Limnobacter三者之间的联系

3 . 7 . ANME--2a细胞外壳结构的组成、结构以及功能分析

4. 全文结论

参考文献

致谢

7. 学术论文和科研成果目录