miR-21调控大鼠BMSCs向肌成纤维细胞分化的机制研究

摘要

研究报导放疗诱导的纤维萎缩机制在放射性颌骨坏死中起重要作用，但具体的调控机制尚不明确。通过多种纤维化疾病研究的文献发现miR-21与TGF-β1在纤维化过程中参与调控作用，因此本实验通过研究大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞分化的过程，探讨 miR-21是否调控了TGF-β1对大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞的诱导分化过程。此研究有望深入阐述放射性颌骨坏死中颌骨纤维萎缩机制的具体调控机制，为进一步治疗和预防提供新靶点。
　　目的：检测TGF-β1诱导大鼠BMSCs成纤维细胞和肌成纤维细胞分化过程中miR-21的基因表达，同时探讨miR-21在体外大鼠BMSCs成纤维细胞分化过程中的调控作用。为治疗颌骨纤维化提供了一个新的靶点。
　　方法：1.原代获得大鼠骨髓间充质细胞，并进行分离纯化培养。并用一定浓度的TGF-β1对大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞进行诱导分化。2. Real-time PCR检测大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞诱导过程中miR-21基因表达水平差异。3.利用miR-21基因模拟物mimics和inhibitor对大鼠骨髓间充质细胞进行转染，使其过表达或者下调，Real-time PCR和Western blot检测肌成纤维细胞的相关基因和蛋白α-SMA的表达，观察 miR-21对大鼠骨髓间充质细胞的生物学影响。3. miR-21基因的mimics模拟物转染大鼠骨髓间充质细胞后，加入一定浓度的TGF-β1，Western blot和免疫细胞化学法检测肌成纤维细胞的相关蛋白α-SMA的表达，从而明确miR-21对大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞的调控作用是否与TGF-β1通路相关。
　　结果：本实验发现一定浓度的TGF-β1可以诱导大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞分化，在此过程中miR-21基因的表达上调，并且具有时间依赖性和剂量依赖性。一定浓度的TGF-β1处理后miR-21表达升高且在处理后的48h表达量达到最高峰值。当TGF-β1的浓度为5ng/ml时，miR-21的表达最高。人工合成的miR-21 mimics转染至大鼠BMSCs后能够有效提高miR-21表达量从而促进了细胞α-SMA基因和蛋白的表达，而人工合成的miR-21 inhibitor转染后能够有效下调miR-21表达量从而降低了细胞α-SMA基因和蛋白的表达；miR-21 mimics增加了TGF-β1刺激大鼠BMSCs向肌成纤维细胞分化的作用，表明miR-21为促纤维化的基因。
　　结论：本研究发现，miR-21能够正调控TGF-β1诱导的大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞分化并高表达α-SMA。本研究为纤维萎缩机制的基因水平研究提供了初步理论依据，为抗颌骨纤维化的基因治疗提出了新的理论。

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缩略语表

绪论

国内外研究状况

本课题研究基础

第一部分 SD大鼠骨髓间充质细胞的分离培养及诱导分化能力研究

1 材料与方法

2 实验步骤

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第二部分 外源性TGF-β1诱导大鼠骨髓间充质细胞miR-21表达的体外研究

1 材料与方法

2 实验步骤

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三部分 miR-21调控大鼠骨髓间充质细胞向肌成纤维细胞分化的体外研究

1 材料与方法

2 实验步骤

3 实验结果

4 讨论

5 结论

结束语

全文总结

工作创新点

进一步工作计划

参考文献

附录

致谢