藤黄生孢链霉菌次级代谢产物生物合成初探

摘要

藤黄生孢链霉菌（Streptomyces luteosporeus NRRL2401）是一种可以产生硫藤黄素（thiolutin）和吲哚霉素（indolmycin)的链霉菌，这两种产物均有着良好的生物活性。为了探索该菌种中的蕴藏的次级代谢产物生物合成信息，本研究针对藤黄生孢链霉菌NRRL2401进行了初步研究。
　　首先，我们对藤黄生孢链霉菌NRRL2401进行了发酵、分离和产物鉴定，确定了该菌株中可以产生硫藤黄素和吲哚霉素，同时对吲哚霉素的发酵条件进行了优化，为后续检测突变株中相应较低产量化合物打下了基础。同时，我们优化了该菌株的产孢条件，利用pSET152、pJTU1278和pPM927为载体，构建了一套稳定高效的遗传操作系统。
　　随后，我们利用了 pCC1FOS作为载体，构建了藤黄生孢链霉菌NRRL2401的基因文库，其中包含2880个克隆，插入片段平均大小为35 kb，覆盖率大于99.9％，可以覆盖基因组16.5倍。这一高质量的文库是后续筛选相应次级代谢产物生物合成基因簇的基础。
　　此外，我们还提取了藤黄生孢链霉菌NRRL2401的全基因组DNA，分别用solexa和SMRT两种方法进行全基因组测序，将两者的数据进行拼接，最终得到6.75 Mb的全基因组序列包含2个重叠群（contig），通过生物信息学软件进行比对，共预测到6222个基因，并对它们进行了功能注释。
　　在得到全基因组序列后，以吲哚霉素为例，我们运用了生物合成途径预测和基因组序列信息分析两种方法对其生物合成基因簇进行了探索，构建的突变株 CXQ-1产生了与野生型藤黄生孢链霉菌 NRRL2401的差异峰，暗示其可能是目前未知的次级代谢产物生物合成基因。对全基因组序列进行了深入的分析，发现其中蕴藏着大量的次级产代谢物生物合成基因，如PKS、NRPS、NRPS-PKS杂合、氨基糖苷类、萜类、铁载体类、羊毛硫抗生素等，为以后深入挖掘该菌的遗传信息提供了基础。其中，我们找到了一个与黄色霉素生物合成基因簇十分相似的区域，可以在以后的研究中尝试“唤醒”该基因簇。此外，我们还针对这其中的一个NRPS基因和一个NRPS-PKS杂合基因进行了基因置换，在得到的突变株CXQ-2，CXQ-3中均有差异峰的出现，为后续进一步验证藤黄生孢链霉菌NRRL2401基因组中的生物合成信息提供了材料。

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目录

第一章 文 献 综 述

1.1 天然产物的研究历史与发展概况

1.2 新的天然产物的来源

1.3 全基因组测序技术的发展

1.3 藤黄生孢链霉菌NRRL2401的研究概况

1.4 本研究背景及意义

第二章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 藤黄生孢链霉菌NRRL2401遗传操作体系的建立及发酵检测

3.1 前言

3.2藤黄生孢链霉菌NRRL2401遗传操作体系的建立

3.3 S. luteosporeus NRRL2401的发酵与产物鉴定

3.4本章小结

第四章 藤黄生孢链霉菌NRRL2401基因文库的建立及全基因组测序

4.1 前言

4.2 S. luteosporeus NRRL2401基因组文库的构建

4.3 S. luteosporeus NRRL2401全基因组的Solexa测序

4.3 本章小结

第五章 吲哚霉素生物合成基因簇的探索

5.1 前言

5.2吲哚霉素抗性基因

5.3 色氨酸β-甲基化基因

5.4其它与色氨酸相关基因

5.5 本章小结

第六章 藤黄生孢链霉菌NRRL2401基因组序列的完善及挖掘

6.1 前言

6.2 基因组序列的完善

6.3 基因组序列中的PKS

6.4 基因组序列中的NRPS

6.5 基因组序列中的NRPS-PKS

6.6 基因组序列中的氨基糖苷类

6.7 基因组序列中的萜类

6.8 基因组序列中的铁载体

6.9 基因组序列中的羊毛硫抗生素

6.10 两个基因置换突变株的构建与发酵

6.11 本章小结

第七章 总结与展望

7.1本研究工作总结及主要创新点

7.2本研究工作展望

参考文献

攻读学位期间发表或已录用的学术论文

致谢