基于自由基理论的仔猪肠道屏障断奶应激损伤机理研究

摘要

早期断奶是集约化养猪生产的关键技术，它不仅可以提高母猪的生产力和圈舍的利用率，而且可以减少母体向仔猪传播疾病的机率，还能提高仔猪的生产性能和后期的胴体品质。而仔猪早期断奶常造成仔猪进食减少、体重下降，肠道绒毛损伤，菌群结构变化，腹泻，统称为早期断奶应激综合征。本课题组前期研究表明，仔猪早期断奶过程会引起严重氧化应激。屏障功能是肠道的一项重要功能，肠道屏障功能的损伤与诸多疾病发生、发展相关，肠道屏障可分为物理屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障。本研究以仔猪断奶为背景，结合IPEC-J2为基础的细胞模型，研究氧化应激对肠道上皮屏障的影响，探讨氧化应激通过损伤肠道上皮屏障造成仔猪断奶应激综合征的机制，同时初步探讨了了抗氧化剂硫辛酸(LA)、N-乙酰半胱氨酸（NAC）及猫须草提取物(OE)对仔猪上皮屏障的调控作用。
　　本研究主要包括以下内容：
　　1.以IPEC-J2细胞为基础的肠上皮细胞氧化应激模型的构建
　　采用CCK8测定不同浓度的过氧化氢及黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(X/XO)对肠道上皮细胞活力的影响，结合荧光探针法测定胞内自由基浓度，确定构建IPEC-J2细胞为基础的肠道上皮细胞氧化应激模型最佳方式为：1) H2O2诱导：1mM过氧化氢作用细胞1h；2)X/XO诱导：250μM黄嘌呤(X)及50U/L黄嘌呤氧化酶(XO)共同作用6h。
　　2.氧化应激诱导肠道上皮细胞凋亡
　　采用流式细胞术及彗星电泳检测不同浓度H2O2及X/XO处理对IPEC-J2细胞凋亡的影响，并采用荧光定量PCR的方法检测了凋亡相关基因的表达。结果表明氧化应激能通过死亡受体途径及线粒体途径造成肠道上皮细胞凋亡。
　　3.氧化应激破坏仔猪肠道上皮屏障功能
　　通过检测断奶仔猪回肠抗氧化指标确定了本研究中断奶仔猪肠道受到氧化应激影响。采用传统比色法测定了断奶仔猪肠腔中消化酶的活力并测定了肠液pH，结果显示断奶应激使仔猪消化酶活力下降，pH无显著变化。通过构建IPEC-J2单层上皮细胞模型并结合仔猪断奶应激模型研究氧化应激对肠道上皮紧密连接的影响，通过qRT-PCR法检测紧密连接蛋白的表达变化。结果表明1mM H2O2诱导的氧化应激破坏上皮紧密连接，使跨上皮细胞电阻(TEER)下降28.46±
　　1.40％，紧密连接破坏的机理可能与氧化应激时紧密连接蛋白ZO-1、Occlaudin及Claudin-1表达下调有关。qRT-PCR法检测显示仔猪断奶氧化应激及H2O2造模均能导致肠道上皮细胞防御素及溶菌酶基因表达下调(p<0.05)。研究表明氧化应激能造成肠道上皮物理屏障、化学屏障及免疫屏障的破坏，其机理可能与氧化应激造成上皮细胞凋亡和活力下降有关。
　　4.抗氧化剂对肠道上皮的氧化损伤的调节作用
　　在过氧化氢诱导的IPEC-J2细胞模型中添加浓度为10μg/ml的LA，810μg/ml NAC或50μg/ml OE，研究抗氧化剂对氧化应激损伤的肠道上皮的保护作用。结果显示，抗氧化剂预保护能有效缓解过氧化氢对IPEC-J2细胞的氧化应激影响，清除胞内自由基、提高细胞活力、降低凋亡细胞数，并上调紧密连接蛋白及防御素、溶菌酶基因的表达，保护肠道上皮屏障。
　　5.宏基因组分析断奶应激对仔猪肠道菌群结构的影响
　　采用Illumina测序方法对21日龄断奶和哺乳仔猪回肠内菌群V4区基因信息进行宏基因组测序分析。结果显示，与哺乳仔猪相比，断奶仔猪回肠中蓝藻门、及Thermi门类的数量显著增多(p<0.05)，而广古菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、无壁菌门及TM7门数量则显著减少(p<0.05)。在属的水平上，针对能准确鉴定的属进行分析，断奶氧化应激造成乳酸杆菌属、双歧杆菌属等23个属丰度减少，11个属丰度增加（部分未鉴定出的属未列入）。丰度减少的属中许多是益生菌，断奶后肠杆菌科菌群数量显著增多。
　　6.氧化应激造成小鼠肠道菌群结构的影响
　　采用注射D-半乳糖诱导小鼠氧化应激，变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测小鼠肠道菌群结构变化，并采用荧光定量PCR检测肠道中乳酸菌及大肠杆菌的数量。结果表明D-半乳糖造模的氧化应激使小鼠小肠内菌群结构显著改变，菌群多样性增加，乳酸菌数量显著下降，大肠杆菌数量显著增多。抗氧化剂NAC能调节肠道菌群结构。
　　7.氧化应激影响乳酸菌及大肠杆菌相对数量改变的机理研究
　　采用传统比色方法分别测定植物乳杆菌ACCC11118及产肠毒大肠杆菌C83907的体外抗氧化能力，并测定不同浓度过氧化氢对体外纯培养的乳酸菌及大肠杆菌的数量影响。通过IPEC-J2细胞与植物乳杆菌共培养测定氧化应激对乳酸菌黏附的影响，并采用荧光定量PCR方法测定了小鼠肠道MUC2、MUC4基因及IPEC-J2细胞MUC1、MUC4基因的表达。结果表明：植物乳杆菌较大肠杆菌有更强的抗氧化能力，氧化应激对混合培养的植物乳杆菌与大肠杆菌数量比有显著影响，使大肠杆菌比例相对下降。氧化应激能下调动物肠道上皮粘蛋白基因表达，降低乳酸杆菌对肠道上皮的黏附。氧化应激影响动物肠道内乳酸菌及大肠杆菌相对数量改变的可能机制为：内源性氧化应激作用于肠道上皮，诱导上皮细胞凋亡，进而粘蛋白基因表达下调，粘蛋白的表达受到抑制，使得乳酸菌与肠道上皮的黏附受到抑制，数目相对减少。而乳酸菌的减少使得乳酸菌的占位效应和抑菌素产生减少，对大肠杆菌的抑制能力减弱，使得大肠杆菌数目增多。
　　由本研究可知，多种因素导致仔猪断奶期内源性自由基增多，造成氧化还原平衡被打破，诱导肠道上皮细胞凋亡，进而造成了包括物理屏障、化学屏障、免疫屏障、微生物屏障在内的肠道上皮屏障破坏，进而导致了仔猪断奶应激综合征的产生。同时，由于猪与人消化道结构与功能的高度相似性，本研究也可作为人类肠道氧化应激屏障损伤研究的参考。

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引言

第一章 前言

第一节 仔猪断奶过程中氧化应激的产生

第二节 应激与肠道屏障

第三节 肠道氧化应激细胞模型的构建

第四节 本研究中采用的抗氧化剂

本研究的目的意义及技术路线

第二章 氧化应激肠道上皮细胞模型的构建

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

第三章 氧化应激对肠道上皮的影响

第一节 氧化应激对IPEC-J2细胞凋亡的影响

第二节 氧化应激对肠道上皮功能的影响

第三节 不同抗氧化剂对肠道上皮的保护作用

本章小结

第四章 氧化应激对肠道微生物结构的影响

第一节 仔猪断奶氧化应激对回肠菌群结构的影响

第二节 半乳糖诱导的氧化应激对小鼠小肠菌群结构的影响

第三节 氧化应激引起动物肠道乳酸菌/大肠杆菌数量改变的机

本章小结

全文分析及总结

仔猪断奶、氧化应激、肠道屏障损伤及断奶应激综合征的关系分析

全文总结

参考文献

附录

附录一 文中常见缩写词速查表

附录二 正文中涉及的补充图表

附录三 文中所有PCR产物的测序结果（不包括宏基因组）

附录四 抗氧化剂的体外抗氧化及浓度选择实验

本文创新点及有待解决的问题

致谢

攻读博士期间发表的论文

答辩决议书