Csk/Src/EGFR参与调节肺肌成纤维细胞定向迁移及肺泡化过程

摘要

目的：支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早产儿中最常见的慢性肺部疾病。其肺组织病理主要表现出次级分隔缩短、肺泡数目减少、体积增大及结构简单化等肺泡化阻滞的现象。胎儿未成熟的肺暴露于宫内炎性环境中，是 BPD发生的重要危险因素。在肺泡化进程中，位于次级分隔顶端的肌成纤维细胞起重要作用。它能分泌弹性蛋白等基质成分，促进次级分隔延伸、成熟，最终将囊泡分隔、重塑形成肺泡。前期试验中，我们通过孕鼠羊膜腔注射脂多糖（LPS）建立新生大鼠BPD模型，发现了肺组织中肌成纤维细胞分布异常。在此基础上，我们进一步探索LPS是否影响了肺组织肌成纤维细胞的定向迁移，从而引起其在肺组织中的分布异常，导致肺泡化阻滞的发生，并探讨Csk/Src/EGFR信号传导在LPS引起肌成纤维细胞定向迁移受损中的作用。
　　方法：⑴孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS后待其自然分娩，取7天新生鼠肺组织，提取原代肺肌成纤维细胞。通过高尔基体极性实验和 Transwell细胞迁移实验观察肌成纤维细胞的定向迁移能力是否受损。同时，体外培养人胚肺肌成纤维细胞，观察 LPS刺激后，细胞定向迁移能力的变化。⑵提取羊膜腔注射 LPS的新生鼠肺组织原代肌成纤维细胞，Western Blot检测细胞中Csk，Src，EGFR蛋白的表达水平，以及Src和EGFR的磷酸化水平，观察其是否被激活；用Csk活性试剂盒检测细胞中Csk的活性。并观察LPS体外刺激人胚肺肌成纤维细胞后，细胞中Csk，Src，EGFR活性的变化。⑶体外培养人胚肺肌成纤维细胞，观察加入外源性rhTGF-α刺激或者用 EGFR特异性抑制剂 AG1478预处理细胞后，细胞定向迁移能力的改变，探讨LPS是否通过EGFR影响细胞的定向迁移。利用shRNA下调Csk表达，或者通过Src抑制剂PP1以及转染Src负隐性（DN-Src）质粒抑制Src激活，观察LPS是否通过Csk/Src影响EGFR的激活以及细胞的定向迁移能力。⑷孕16.5天的SD大鼠羊膜腔同时注射LPS和EGFR抑制剂Erlotinib，取7天新生鼠肺组织，HE染色观察肺组织病理改变，免疫荧光染色观察肌成纤维细胞的分布，探讨Erlotinib是否改善了LPS引起的肺组织BPD病理改变和肌成纤维细胞分布异常。
　　结果：①羊膜腔注射LPS的新生大鼠肺组织肌成纤维细胞较注射生理盐水的肺肌成纤维细胞高尔基体极化能力降低（74.39±0.6848％vs56.95±1.457%，p<0.01），细胞迁移减少（46.27±5.347 vs20.07±4.631，p<0.05）。体外LPS刺激人胚肺肌成纤维细胞后，细胞的定向迁移能力同样受损（高尔基体极化率降低：60.12±0.7442%vs41.65±0.7777%，p<0.01；迁移细胞数减少：37.6±1.208 vs19.6±0.8778，p<0.01）。②羊膜腔注射LPS的新生鼠肺组织原代肌成纤维细胞中各蛋白表达水平无明显变化，但 Csk活性降低（降至73.6%），Src、EGFR磷酸化水平增高（分别升高2.6倍，1.96倍）。同样的，体外LPS刺激人胚肺肌成纤维细胞30min后，细胞中Csk活性出现降低（降至70.3%），Src、EGFR磷酸化水平增高（分别升高2.2倍，1.5倍）。③加入 rhTGF-α刺激细胞后，观察到与 LPS作用类似的高尔基体极化率降低，迁移细胞数减少的现象，表明细胞定向迁移能力受损。而EGFR抑制剂AG1478可以阻断LPS或者TGF-α对细胞定向迁移的影响。用PP1抑制Src活性或者转染DN-Src质粒，则可阻断LPS对细胞中EGFR活性和细胞定向迁移能力的影响。进一步利用shRNA下调细胞中Csk表达后，也观察到与LPS作用类似的EGFR活性增高，细胞定向迁移能力受损的现象。④羊膜腔同时注射LPS和EGFR抑制剂Erlotinib的肺组织较单独注射LPS的肺组织中次级分隔数和终末肺泡数均有增高，分布在次级分隔的肌成纤维细胞也增多，Erlotinib改善了LPS引起的肺泡结构简单化和肺肌成纤维细胞分布异常的现象。
　　结论：我们发现了炎症引起支气管肺发育不良（BPD）发生的重要分子机制：LPS可能通过Csk激活Src后，反式激活EGFR，使肌成纤维细胞定向迁移发生异常，不能正确定位到次级分隔顶端，从而引起肺泡化阻滞，最终导致BPD的发生。

目录

中英文缩略词表

绪论

第一部分 LPS对肺肌成纤维细胞定向迁移能力的影响

1.1实验材料

1.2实验方法：

1.3实验结果

1.4讨 论

第二部分 LPS对肌成纤维细胞中迁移相关蛋白活性的影响

2.1实验材料

2.2、实验方法：

2.3实验结果

2.4讨 论

第三部分 LPS通过Csk/Src/EGFR调节肌成纤维细胞定向迁移

3.1实验材料

3.2、实验方法：

3.3结 果

3.4讨 论

第四部分 EGFR抑制剂Erlotinib改善了LPS对肺组织病理的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果（注：部分试验由师兄李健辉完成）

4.4讨论

结论

参考文献

致谢

附录一：综述:Rho家族对细胞迁移与细胞极性的影响

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