基于二氧化硅纳米材料的siRNA递送系统的构建及其在肿瘤治疗中的应用研究

摘要

介孔二氧化硅纳米颗粒（Mesoporous Silica Nanoparticles，MSNs）由于具备较大的比表面积、可调的介孔孔径、易被修饰的表面特性和良好的生物相容性，在药物、核酸和蛋白质等小分子的转运中已经有了比较系统的研究。但是，基于磁性介孔二氧化硅纳米材料（M-MSNs）的siRNA载体对体内肿瘤治疗的应用还有待进一步研究和探讨。
　　本工作在本课题组前期研究基础上首次将 M-MSN_siRNA@PEI-KALA颗粒体系通过瘤内注射方式应用到体内肿瘤的治疗，实现肿瘤的有效抑制。随后，在M-MSN_siRNA@PEI-KALA的基础上，通过进一步PEG化修饰，获得可以进行循环注射治疗的M-MSN_siRNA@PEI-PEG-KALA颗粒体系，实现对多种体内肿瘤模型的有效干预。最后，开发一种全新的、快速合成的siRNA和doxorubicin共载带体系，初步实现了该共载带体系对耐药性肿瘤细胞的协同抑制作用。
　　首先，我们设计和筛选了针对人 VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）基因的有效siRNA序列。通过转染M-MSN_VEGF siRNA@PEI-KALA颗粒进入A549细胞（人肺腺癌细胞株），可以有效抑制细胞内VEGF基因的表达；构建 A549肺癌皮下瘤模型，通过瘤内注射 M-MSN_VEGF siRNA@PEI-KALA颗粒可以显著下调瘤内VEGF蛋白的含量，减少新生血管形成，抑制肿瘤生长。但是，M-MSN_siRNA@PEI-KALA颗粒体系在生理条件下会发生团聚，不能实现更接近于临床应用的循环治疗方案。
　　鉴于M-MSN_siRNA@PEI-KALA颗粒体系在生理条件下的应用局限性，我们引入具备空间位阻效应和良好生物相容性的聚乙二醇（PEG）高分子，最终形成 M-MSN_siRNA@PEI-PEG-KALA颗粒体系。该颗粒体系能在生理环境中维持单分散，对肿瘤细胞、正常体细胞和红细胞都具备良好的生物相容性，并且通过转染该颗粒可以高效的抑制肿瘤细胞内靶基因的表达。后续的药代动力学和生物分布研究发现，该颗粒体系可以有效提高siRNA的血液循环时间，并通过EPR（Enhanced Permeability Retention）效应促进颗粒在肿瘤内的富集。随后构建裸鼠的A549肺癌皮下瘤模型以及原位瘤模型，经尾静脉注射M-MSN_VEGF siRNA@ PEI-PEG-KALA颗粒可以显著抑制皮下瘤和原位瘤的生长，同时也能高效抑制由原位瘤模型定向转移形成的肝转移灶。在此过程中，5次重复注射该颗粒不会对血常规、基本血液生化指标产生显著影响，也不会破坏重要脏器的基本组织形态，具备较高的生物安全性。另外，颗粒体系内含有的超顺磁性Fe3O4核可以作为良好的T2造影剂，可以对A549肺癌皮下瘤、原位瘤及肝转移灶进行示踪，通过MRI信号的明暗变化调整颗粒的注射剂量和治疗窗口。因此，该颗粒有望成为一种新型的诊疗一体化纳米载体。
　　众所周知，联合治疗是更有效的癌症治疗手段。因此，我们开发了一种全新的、快速合成的，基于二氧化硅材料的siRNA和Doxorubicin共载带体系，构建原理是 Doxorubicin可以插入到 siRNA的GC碱基对中形成siRNA&Doxorubicin复合物，然后以该复合物为模板，引入辅助结构导向剂（CSDA）和无机硅源，最终形成siRNA&Doxorubicin@SiO2颗粒体系。后续实验证明，该颗粒体系能高效装载siRNA和Doxorubicin，且两者的生物学功能不会因为Doxorubicin插入到siRNA形成siRNA&Doxorubicin复合物而受到影响。转染MDR-1 siRNA&Doxorubicin@SiO2进入MCF-7/MDR细胞（人Doxorubicin耐药乳腺癌细胞株），可以提高该细胞对Doxorubicin的敏感度，增强Doxorubicin对该细胞的杀伤效果。

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第一章 绪论

1.1 癌症治疗面临的挑战

1.2RNA interference（RNAi）作为一种新型癌症治疗策略

1.3 siRNA药物体内输送至肿瘤部位的困难和挑战

1.4 循环注射后siRNA在体内的输送策略

1.5 课题的确立和欲解决的问题

1.6 本论文的目的、研究内容和创新性

第二章 M-MSN_siRNA@PEI-KALA对肺癌治疗的应用

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果和讨论

2.4 本章小结

第三章 M-MSN_siRNA@PEI-PEG-KALA对肺癌治疗的应用

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果和讨论

3.4 本章小结

第四章 一步法快速构建基于SiO2材料的siRNA-Doxorubicin共载体系及其逆转MCF-7/MDR细胞耐药的研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果和讨论

4.4 本章小结

第五章 全文总结

5.1 主要结论

5.2 研究展望

符号和标记

攻读博士学位期间已发表或录用的论文

致谢

参考文献