刺槐有效成分D松醇的分离鉴定、生物活性及其对黄瓜白粉病的作用机理研究

摘要

黄瓜白粉病(powdery mildew disease)是由病原真菌Sphaerotheca fuliginea侵染引起的，一种对温室及田间瓜类作物造成严重损害的世界性病害。由于化学农药容易使病菌产生抗药性，不易降解造成环境污染以及对生物的毒性等不利因素，越来越多的生物防治逐渐成为研究热点。研究报道发现，刺槐提取液对黄瓜白粉病具有抑制作用。但是，提取液中的活性成分以及活性成分的作用机理仍然未知。本研究对刺槐提取液中的活性成分进行了分离纯化，从中鉴定出活性化合物D松醇。通过响应面法优化了D松醇的提取工艺。测试了D松醇的抗菌、杀虫以及对植物的生长调节作用。研究了 D松醇对黄瓜白粉病的作用机理，利用光学显微镜观察研究了D松醇作用下黄瓜白粉病菌的形态学变化；研究了D松醇对黄瓜叶片组织中相关防御代谢物质和生理酶的影响；以及 D松醇对抗病相关基因转录水平的影响。将 D松醇配制成20％水剂，经过苗期盆栽试验以及两年四地的田间药效试验，验证了其对黄瓜白粉病的防治效果。研究结果如下：
　　1.采用活性示踪法对刺槐提取液中的活性成分进行分离纯化，利用核磁共振技术其结构被鉴定为D松醇。植物样品经衍生化处理后使用气相色谱对D松醇进行定量，在刺槐中的含量为25 mg/g（叶片干重）。为了降低成本，以菜豆秸秆为原材料，对采摘后12个栽培品种的菜豆秸秆中的D松醇含量进行测定。品种Z98002中的D松醇含量最高，为叶片干重的30.4 mg/g，各组织中D松醇的含量大小依次为：叶>茎秆>豆荚>菜豆果实。通过响应面设计优化D松醇的提取工艺，其最佳提取工艺为：温度66℃,提取时间90分钟，料液比1:10，可获得31.4 mg/g的提取率。
　　2.研究了D松醇对不同病原菌引起的黄瓜白粉病、烟草白粉病及草莓白粉病的抑制效果。离体实验表明，D松醇可抑制三种白粉病原菌孢子萌发；在盆栽试验中测试了不同浓度的D松醇水溶液对三种植物白粉病的防治效果。D松醇对黄瓜白粉病的预防效果与治疗效果EC50分别为0.45与0.41 mg/ml。高浓度的D松醇(2 mg/ml)对朱砂叶螨具有防治效果，而低浓度的D松醇(0.1 mg/ml)对六种植物（稗草、小麦、马唐、苋菜、黄瓜、油菜）的生长具有一定的促进作用。
　　3.研究了D松醇对黄瓜白粉病的作用机理。对接种白粉病菌后的黄瓜在不同时间段进行D松醇喷雾处理(2 mg/ml)，设置清水作为对照，显微镜观察D松醇对黄瓜叶片上白粉病菌的影响。试验结果显示，D松醇可使白粉病菌的分生孢子、菌丝及分生孢子梗的细胞结构遭到破坏。对接种3天后的黄瓜进行D松醇处理可达到最高的治疗效果。D松醇处理提高了病原菌侵染后的黄瓜植株体内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POX）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等四种抗病相关酶的活性，伴随着总酚、没食子酸类及叶绿素含量的增加；同时增强了受病原菌感染的黄瓜植株体内Chit1,PR-1,Pox，Pal1和Lox1等防御基因的转录水平。
　　4.配制成稳定高效的D松醇水剂。该水剂配方为：D-pinitol:20%;吐温245:6%;乙二醇:5%和吐温3001:4%。室内苗期生测结果显示：浓度为0.5 mg/ml的D松醇水剂对黄瓜白粉病的预防效果为94.4%，提高了D松醇的使用效果；对发病严重的烟草白粉病的治疗效果为58.1%。富含D松醇的菜豆提取液同样具有防治黄瓜白粉病的效果，防效随D松醇浓度的增加而提高；制剂化后的提取液可进一步提高防效。两年四地田间实验结果显示：D松醇水剂可对多个黄瓜品种上不同病原菌引起的白粉病产生抑制效果；高浓度的D松醇水剂可达到76.5-82.2%防效，优于或等同于推荐剂量的常用化学对照：乙嘧酚磺酸酯乳油、硫磺悬浮剂、甲基硫菌灵和乙嘧酚。

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第一章 文献综述

1.黄瓜白粉病的研究进展

2. 植物源杀菌剂的研究进展

3. D松醇的研究进展

4. 研究的目的和意义

5. 研究内容

第二章 刺槐提取物抗黄瓜白粉病活性成分的分离与鉴定

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

4. 小结

第三章 D松醇的生物活性测试

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

4. 小结

第四章D松醇防治黄瓜白粉病的机理研究

1． 材料与方法

2． 结果与分析

3． 讨论

4. 小结

第五章 20% D松醇水剂的田间药效试验

1． 材料与方法

2． 结果与分析

3． 讨论

4． 小结

第六章 本文结论、创新点与展望

1． 结论

2． 创新点

3． 展望

参考文献

致谢

附件1：攻读博士学位期间已发表或录用的论文

附件2：攻读博士学位期间已授权或申请公开的专利