青蒿萜类合成酶基因及启动子的克隆与功能分析

摘要

萜类化合物以异戊二烯（C5）为结构单元构成了植物界中最大的天然化合物家族，是植物次生代谢物中重要的组成部分。植物通过次生代谢合成多种萜类化合物以防御各类生物和非生物胁迫。萜类还具有重要经济价值，可用作香精香料、药物以及杀虫剂等等。萜类合成酶通常是催化萜类化合物合成途径的第一个关键酶，其基因表达受到转录因子、激素、逆境等多种因素的调控，进而构成了复杂的次生代谢网络。
　　青蒿（Artemisia annua L.）是一年生草本植物，其次生代谢产物中的青蒿素是重要的抗疟疾药物。同时，青蒿精油中还富含功能各异的单萜和倍半萜，例如1,8-桉叶醇，石竹烯，青蒿酮等等。青蒿素合成途径中的ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1等关键结构酶基因已被发现，然而还存在较多其他的萜类合成酶基因有待克隆和鉴定，以加深对萜类化合物功能和结构的了解。
　　本研究从青蒿腺毛转录组文库中克隆得到两条萜类合成酶基因AaTPS7和AaTPS8。生物信息学分析结果显示AaTPS7全长1863 bp，编码含620个氨基酸的蛋白，与青蒿中几种单萜合酶有较高的同源性。AaTPS8全长1683 bp，编码含560个氨基酸的蛋白，与菊科不同植物的大根香叶烯A合酶同源性较高。体外酶催化实验表明AaTPS8是一种倍半萜合酶，能催化FPP生成三种产物，主产物为臭根醇。虽然GC-MS没有检测到AaTPS7催化FPP或GPP生成的产物，但经过多重序列比对和进化分析后，推测其为单萜合酶。实时荧光定量PCR结果显示AaTPS7和 AaTPS8在青蒿不同组织和不同部位叶片中不同程度表达，在幼嫩的叶片，茎或花蕾中的表达量相对较高。
　　运用基因组步移法克隆了AaTPS7和AaTPS8的启动子区域，长度分别为1167 bp和1629 bp。生物信息学分析发现了启动子中存在多个顺式调控元件，例如WRKY类转录因子结合位点W-box和MYB类转录因子结合位点MBS，以及响应MeJA的CGTCA-motif和响应ABA的ABRE元件，推测两个启动子可能受到转录因子、机械损伤等多种因素的调控。构建启动子与 GUS基因的融合载体并转化青蒿，GUS染色结果表明这两个启动子驱动基因在非分泌型腺毛中的特异表达，而在分泌型腺毛中完全没有染色。由于青蒿素的合成和储存都发生在分泌型腺毛，因而推测AaTPS7和AaTPS8与青蒿素的合成关联较小。对转基因青蒿喷洒MeJA和ABA，3小时后GUS基因表达水平有所上调，说明proTPS7和proTPS8能受到两种激素的诱导。组成型启动子普遍应用于基因工程研究，但仍存在许多不足。腺毛特异性启动子的发现有助于进一步了解启动子的调控机理，有潜力替代组成型启动子，在代谢工程中实行更为精细的改造。
　　综上所述，本研究克隆和分析了青蒿AaTPS7和AaTPS8基因及相应的启动子，为以后进一步了解青蒿次生代谢网络，人为调控合成途径以提高目标产物含量提供了可能性。

目录

声明

缩略词表

第一章 绪论

1.1 萜类化合物概况

1.2 青蒿萜类合酶研究进展

1.3 研究目的和内容

第二章 材料和方法

2.1 实验材料及试剂

2.2 实验方法

第三章 结果与分析

3.1 AaTPS7和AaTPS8基因克隆及生物信息学分析

3.2 AaTPS7和AaTPS8基因的表达谱特征分析

3.3 AaTPS7和AaTPS8蛋白的原核表达

3.4 AaTPS7和AaTPS8的体外功能分析

3.5 AaTPS7和AaTPS8启动子的克隆及分析

3.6 启动子稳定转化青蒿及GUS染色

3.7 激素处理下转基因青蒿GUS表达分析

第四章 总结与展望

4.1 总结与讨论

4.2 创新点

4.3 后续研究工作展望

参考文献

附录

致谢

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