基于全外显子组测序的孤独谱系障碍核心家系基因筛查研究及氟西汀早期处理斑马鱼的行为学改变

摘要

第一部分童年瓦解性精神障碍合并粘多糖症ⅢA的同胞家系遗传学研究
　　目的:
　　童年瓦解性精神障碍（Childhood disintegrative disorder，CDD）作为孤独谱系障碍中的特殊亚型，是罕见的早发神经退行性疾病。但临床报道甚少且致病机制不清。本研究以一对患CDD的同胞兄弟为对象，利用现有的研究方法探索其可能的致病因素。
　　方法:
　　首先，利用全外显子组测序（whole exome sequending,WES）对包括两位患儿和健康父母在内的家系进行筛查分析；其次再结合临床量表评估其症状表现，包括孤独症诊断访谈问卷（修正版）（ADI-R）、孤独症行为量表（ABC）和儿童孤独症评定量表（CARS）；再对所有家庭成员进行核磁共振脑影像检测（MRI），MRI扫描序列程序包括T1、T2和DTI；最后，行相关的生化检查包括尿粘多糖检测（uGAG）及溶酶体酶活力检测。
　　结果:
　　据WES数据分析，两位先证者的SGSH基因均出现纯合突变：p.F101S（c.302T>C），父母均携带同样位点的杂合突变，符合常染色体隐性遗传病模式。MRI检查发现患儿皮质普遍且严重萎缩，沟回加深，脑室扩张；白质纤维变性，尤其胼胝体膝部、压部变薄。ADI-R得分表明社交互动和语言交流方面都远超临界值，刻板行为相对较轻；CARS结果提示达到重度孤独症的程度；ABC得分也远高于孤独症筛查诊断界限分，且在两年后随访分数明显增加。酶学检测发现患儿乙酰肝素-N-硫酸酯酶活性下降,尿粘多糖定性阳性。
　　结论:
　　本研究明确了该对患儿致病位点 SGSH p.F101S。SGSH的突变直接导致该所编码的乙酰肝素-N-硫酸酯酶的功能缺陷，引起粘多糖病III型A（MPS IIIA）。因此患者出现的症状可能与粘多糖累积有关。本研究也为CDD的病因提供了一种可能的解释，进一步给临床医生以鉴别诊断的线索。
　　第二部分利用全外显子组测序在120例孤独谱系障碍的家系中筛查MeCP2突变
　　目的:
　　甲基化 CpG结合蛋白2(MeCP2)能通过表观遗传作用调节神经发育的重要蛋白，它的功能缺失或获得性突变都会导致严重的神经发育性疾病，如瑞特综合症（Rett syndrome，RTT）和孤独谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，ASD）。本研究对 ASD患者展开了广泛筛查，以期检测 MECP2突变，并对突变行初步的功能探究。
　　方法:
　　对120位罹患ASD的儿童抽取外周血以提取基因组DNA用于WES筛查，对其中筛出 MECP2突变的先证者及父母用Sanger测序验证突变。用电转法将MeCP2野生型、突变型的体外表达载体法转入离体培养的小鼠皮层神经元细胞及HEK-293细胞。蛋白印迹实验验证MeCP2的特异性表达并用免疫组化显示并观察神经元形态发育。
　　结果:
　　经测序分析发现3个 MECP2基因突变：c.455C>T，p.P152L；c.1162C>T，p.P376S和c.880C>T，p.R294X。其中p.P152L是未在患者中报道过的新突变，p.P152L和p.R294X为新发突变（de novo mutation），p.P376S突变遗传自母亲。MeCP2人源野生型及p.R294X截短突变过表达的主要对神经元的树突发育有抑制的作用，而突变型(p.P152L，p.P376S)表达的神经元树突及轴突的长度则无明显改变。
　　结论:
　　通过对孤独症患者中筛出的MeCP2突变功能的初步探究，提示突变很可能影响到MeCP2调节神经元发育的相关功能，从而引起神经元突起的长度的改变。本研究也提示MeCP2虽然在孤独症患者中突变频率不高，但仍是需要检测的重要候选基因。
　　第三部分氟西汀早期处理对斑马鱼幼鱼急性期及远期行为的影响
　　目的:
　　SSRI类抗抑郁药用于控制孤独症患儿的焦虑、抑郁等情绪症状及强迫行为，而氟西汀是其中最常使用的。通过研究早期暴露于氟西汀的斑马鱼，探索该药物对斑马鱼主要神经递质、自主运动、焦虑样行为及远期社交功能的影响。
　　方法:
　　用氟西汀早期慢性处理斑马鱼（受精后3到6天，3-6dpf），通过高效液相色谱法（HPLC）检测斑马鱼脑部主要神经递质及代谢产物水平；通过明暗交替实验中斑马鱼的趋墙行为来判断焦虑样行为（7-9 dpf）；用社交偏好实验评估斑马鱼社交行为的远期发展（30dpf）。
　　结果:
　　随氟西汀剂量的增加，5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）水平不断升高，而5-羟色胺（5-HT）、多巴胺(DA)及3,4-二羟苯酰乙酸（DOPAC）在幼鱼（7dpf）脑内水平先增后减。在自主运动中，7dpf的氟西汀组游动距离显著低于对照组（P<0.05）；在7dpf时氟西汀低剂量组（1.6μM、4μM）在连续光照情况下趋墙行为较对照组少（P<0.05）。在社交偏好实验中，对照组在毗邻鱼群的区域内总游动距离显著高于氟西汀4μM和8μM组（P<0.01）；相应游动时间的比较结果，也是对照组多于氟西汀4μM和8μM组（P<0.05）。
　　结论:
　　斑马鱼早期暴露于氟西汀，急性期对自主运动有抑制作用，低剂量组趋墙行为减少提示可能有抗焦虑作用。HPLC检测结果提示氟西汀对DA和5-HT系统有影响，且在远期检测发现处理组社交能力受损，提示可能通过改变5-HT系统水平或功能，对神经发育过程产生持续作用，继而影响到其社交能力。

目录

缩略词表

绪论

1．孤独谱系障碍概述

2． ASD的罕见特殊亚型：童年瓦解性精神障碍

3．孤独症的遗传学研究近况

4． MeCP2表达异常引发神经发育性疾病

5．SSRI类药物应用于孤独症的辅助症状控制

6．在斑马鱼等模式生物上进行SSRI类药物作用探究

第一部分 童年瓦解性精神障碍合并粘多糖症ⅢA的同胞家系遗传学研究

1. 前言

2. 对象和方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分利用全外显子组测序在120例孤独谱系障碍的家系中筛查MeCP2突变

1．前言

2．对象和方法

3．结果

4．讨论

第三部分 氟西汀早期处理对斑马鱼幼鱼急性期及远期行为的影响

1. 前言

2. 对象和方法

3.结果

4. 讨论

参考文献

附录

附录1 知情同意书（患者版本）

附表1 MECP2基因P376位点报道过的突变及患者基本情况汇总

附表2 MECP2基因P152位点报道过的突变及患者基本情况汇总

附表3 MECP2基因R294突变位点报道过的突变及患者基本情况汇总

主要工作和创新点

致谢

学术论文和科研成果

声明