尼古丁通过Nme2介导的端粒缩短促进小鼠生精细胞凋亡

摘要

研究背景与目的：吸烟是全球最大的公共卫生卫生问题之一。研究证实吸烟对男性生殖健康有着不利影响。实验室的前期工作证明，使用香烟烟雾处理雄性小鼠可以促进精子DNA的断裂、生精细胞的凋亡等，进而影响其精液质量并降低子代小鼠的出生率和存活率。目前研究发现，引发凋亡可能有多种因素，如激素和生长因素失衡、细菌、病毒侵袭、理化因素导致的DNA受损等。前期实验发现小鼠精子转录本中部分基因表达量会受到香烟烟雾中主要有害物质——尼古丁的影响，其中的Nme2基因，其表达产物NME2蛋白与端粒酶活性相关，提示其有可能通过影响生精细胞中端粒合成，继而影响生精细胞凋亡。为了探讨吸烟对生精细胞凋亡的影响，本文重点从生精细胞中的端粒变化考察尼古丁影响生精细胞凋亡的分子机理。
　　研究方法：以模拟人重度吸烟（每日吸烟20支）的尼古丁摄入量处理小鼠建立实验小鼠模型。使用 TUNEL法检测小鼠睾丸中细胞凋亡情况，并进一步使用Realtime PCR和TRAP-Realtime PCR法分别检测睾丸和精子中的端粒平均相对长度及睾丸中端粒酶活性。
　　从尼古丁处理组和对照组精子转录本二代测序结果中筛选出能与端粒酶结合并影响其活性的差异表达基因Nme2，接着用 RT-PCR和Western blot方法检测Nme2基因在睾丸中的表达量，并使用BSP的方法，检测两组小鼠睾丸中 Nme2基因启动子区域甲基化水平并验证甲基化水平对NME2蛋白表达水平的影响。构建NME2蛋白过表达和尼古丁处理Hela细胞模型，使用上述方法分别检测其端粒酶活性、端粒平均相对长度及凋亡水平。
　　研究结果：检测到尼古丁处理小鼠睾丸中精原细胞和长形精子细胞凋亡率明显增加，睾丸中端粒酶活性显著降低，精子中平均端粒长度明显减少。进一步实验发现尼古丁能够诱使小鼠睾丸中Nme2基因启动子区域低甲基化并且与之相应的上调小鼠睾丸中的Nme2基因转录量和NME2蛋白表达量。
　　在构建的NME2蛋白过表达和尼古丁处理Hela细胞模型中，与对照组相比，均检测到较低的端粒酶活性、较短的端粒长度以及更高的细胞凋亡率。提示我们NME2蛋白能够在细胞内降低端粒酶活性，减少端粒长度，并且促进细胞凋亡。
　　结论：尼古丁能够在睾丸中通过促进Nme2基因启动子区域低甲基化从而上调NME2蛋白的表达，抑制了细胞内的端粒酶活性，阻碍端粒的合成，导致部分细胞端粒无法得到补充，致使染色体DNA不稳定，促进小鼠生精细胞的凋亡。

目录

符号与缩写

第一章 绪论

1.1哺乳动物精子发生的生物学过程

1.2吸烟与男性生殖

1.3端粒与生殖

1.4 NME2蛋白与端粒酶结合影响其活性

1.5端粒长度及端粒酶活性检测方法

第二章 尼古丁对小鼠生精细胞凋亡和端粒长度的影响

2.1背景介绍

2.2实验仪器

2.3实验试剂

2.4试剂配制

2.5实验方法

2.6实验结果

2.7结果讨论

第三章 尼古丁促进小鼠端粒凋亡的可能机制研究

3.1背景介绍

3.2实验仪器

3.3实验试剂

3.4试剂配制

3.5实验方法

3.6实验结果

3.7结果讨论

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

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