大珠母贝微星DNA的分离筛选及其遗传多样性研究

摘要

大珠母贝主要分布于中国、印尼、澳大利亚等国的热带和亚热带海区，是生产海水珍珠的最大的贝类，具有极高的经济价值。本文采用生物素标记的(CA)15探针和磁珠富集法构建了大珠母贝的基因组微卫星富集文库，并设计引物进行PCR筛选，获得了10个多态位点。利用这10个多态位点，对海南三亚的养殖大珠母贝群体以及中国、印度尼西亚的大珠母贝养殖群体的遗传多样性和遗传分化进行了分析，目的是为大珠母贝的种质资源保护和遗传选育提供基础资料。
　　 1.通过构建的大珠母贝基因组微卫星富集文库中，共得到近2000个单克隆菌落，随机挑选1200个克隆用探针引物(CA)15和载体引物进行第2次筛选，获得候选克隆298个。测序结果表明，微卫星序列长度范围是101-787bp，其中211个含有251个微卫星微卫星结构域。其中两碱基(CA/GT)n重复序列有204个，占了绝大多数(81％)，此外还发现了AG、AT、GC、TC、CAA、AGG、GATA、GACA、GTGC、GACG等重复类型。在获得的251个微卫星位点中，完美型微卫星159个，占63％;非完美型80个，占32％;复合型12个，占5％。用引物设计软件primer5.0设计引物90对，合成30对，筛选出21对有效扩增的引物，种群扩增获得10个多态位点。
　　 2.对我国海南三亚大珠母贝3个不同世代(2007、2009和2010)的养殖群体进行PCR扩增后发现：3个群体共90个个体(3×30)在10个多态位点共检测出60个等位基因，每个位点等位基因数2-8个，平均每个位点6个，3个群体在这60个等位基因中分别丢失了1个、2个和4个稀有等位基因。平均期望杂合度（He）分别为0.7179、0，6947、0.6795，平均观测杂合度（Ho)分别为0.5333、0.4267、0.4833。平均多态信息含量PIC值分别为0.6399、0.6714、0.6295。Shannon多样性指数平均值分别为1.4741、1.3798、1.3757。平均遗传偏离指数D值均为负，表明群体中存在一定程度的杂合子缺失。Hardy-Weinberg平衡卡方检验，在所检测的30个数据中（3个种群×10个位点），有18个偏离了遗传平衡。两两群体间的平均近交系数介于0.2273-0.2601之间，表明群体内的近交程度比较严重。两两群体间的平均遗传分化指数介于0.0204-0.0462，遗传分化显著（P＜0.01）。上述结果表明，3个世代的群体遗传多样性水平已经出现了逐渐降低的趋势，近交程度增加，因此人工繁育工作中应注意避免遗传多样性的降低。
　　 3.中国和印尼大珠母贝群体遗传多样性的分析表明：三亚群体和印尼群体的平均等位基因数分别是5.8和5.5；平均期望杂合度分别是0.6947和0.6624;平均观测杂合度分别是0.4267和0.4300;平均Shannon多样性指数分别是1.3798和1.3354;平均多态信息含量PIC值分别是0.6399和0.6111.，表明两个群体的遗传多样性水平都比较高。显著性检验表明，三亚群体的遗传多样性水平高于印尼群体（P＜0.01）。Hardy-Weinberg平衡的卡方检验发现，20个数据（2个群体×10个位点）中，有一半偏离了平衡状态。两个群体间遗传相似系数和遗传距离分别为0.7919和0.2333，遗传分化指数为0.0485，遗传分化水平较弱(FST＜0.05),两群体间的遗传差异较显著（P＜0.01）。

目录

文摘

英文文摘

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引言

第一章 文献综述

1 大珠母贝简介及其研究现状

1.1 大珠母贝简介

1.2 大珠母贝研究现状

2 遗传多样性及其检测方法

2.1 遗传多样性的定义

2.2 遗传多样性的检测方法

3 微卫星分子标记技术

3.1 微卫星及其产生机理

3.2 微卫星标记的优点及缺陷

3.3 微卫星分子标记的分离方法

3.4 微卫星分子标记在贝类遗传育种中的应用

4 研究的目的和意义

第二章 大珠母贝微卫星标记的分离与筛选

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.2 实验仪器

1.3 实验试剂

1.4 实验方法

2 结果与分析

2.1 大珠母贝基因组微卫星文库的构建

2.2 微卫星的筛选

2.3 微卫星多态性分析

3 讨论

第三章 大珠母贝不同世代养殖种群的遗传多样性

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.2 实验仪器

1.3 实验试剂

1.4 实验方法

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

2.2 群体的遗传多样性

2.3 遗传变异与遗传分化

3 讨论

第四章 大珠母贝不同地理种群的遗传多样性

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.2 实验仪器

1.3 实验试剂

1.4 实验方法

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

2.2 遗传多样性与遗传分化

3 讨论

第五章 小结与展望

参考文献

附录1 缩略词表

附录2 硕士期间发表的论文和参加的会议

致谢