中华绒螯蟹脑组织促性腺释放激素类似物分离、免疫定位及功能鉴定

摘要

卵母细胞在完成卵黄积累后,减数分裂重启,进入最后的生理(减数分裂)成熟阶段,只有达到最后的生理成熟,卵母细胞才能正常排卵、受精。卵母细胞最终成熟以生发泡破裂(germinal vesicle break down，GVBD)为标志,在脊椎动物,卵母细胞最终成熟受下丘脑分泌的促性腺释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)调控,GnRH通过刺激垂体释放卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH),诱发GVBD,导致卵母细胞成熟,但在虾蟹类甲壳动物是否存在类似调控通路尚不清楚。
　　本研究以我国重要的水产养殖动物中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,应用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)从中华绒螯蟹脑组织提取液分级分离了GnRH类似物,使用章鱼促性腺释放激素抗体(anti-octGnRH)对分离组分进行免疫斑点印迹实验鉴定,获得了高纯度免疫反应呈阳性GnRH类似物分离组分,对该 GnRH类似物进行基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析,结果表明,蟹脑组织中GnRH类似物具有两个亚型,均为十一肽,即QSYHFSHGWKP与QAYHFSHGWKP,分别命名为EsGnRH-Ⅰ和EsGnRH-Ⅱ,分子量为1356.6Da与1373.6D。与其他物种30种 GnRH类型进行比对显示中华绒螯蟹 GnRH类似物氨基酸序列具有GnRH家族相同氨基酸保守位点,其中 Q1、H4、S6、G8、P11五个氨基酸位点与脊椎动物的GnRH-Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型完全相同,W9位点与脊椎动物GnRH-Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型相完全一致。同时该类似物具有无脊椎动物GnRH典型结构,即与脊椎动物类似物相比在第一位氨基酸后同样多插入了两个氨基酸,并且具有无脊椎动物相一致的F5位点,特别是其中一种亚型与与海生蠕虫 GnRH仅在第十位氨基酸有差异。随后根据获得多肽序列,制备兔抗中华绒螯蟹GnRH类似物抗体(anti-EsGnRH),使用anti-EsGnRH进行脑组织免疫组化分析,结果表明,在前脑的第8与11号细胞群中发现中型与小型细胞的细胞质中发现免疫阳性物质,并且在中脑第10号细胞群发现小型细胞的细胞质中有免疫阳性物质,最后在嗅叶外周的小型细胞的细胞质中发现免疫阳性物质。在后脑部位虽然没有发现免疫阳性细胞群,但是在连接后脑和胸神经节的食道下神经节以及第二触角神经纤维中发现免疫阳性物质分布在神经束中,表明GnRH分泌后可能通过这两条神经通道运输到靶细胞部位,对卵母细胞最终成熟过程产生影响。为了进一步验证这一推断,根据氨基酸序列人工合成中华绒螯蟹EsGnRH-Ⅰ、EsGnRH-Ⅱ,通过活体注射人工合成GnRH进行诱导卵母细胞成熟实验,结果表明,单独注射时这两种亚型均可促进卵母细胞 GVBD发生,与空白对照组相比均具有显著性差异(P<0.05),特别是EsGnRH-Ⅰ注射组在500ng/ml时效果最为明显,GVBD比例为40％,与空白对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)。两种亚型同时注射与单独注射效果相同,没有表现出协同作用。在脊椎动物中 GnRH末端均存在高度保守甘氨酸(Gly,G)位点,为了验证该位点对EsGnRH活性的影响,人工合成添加G的突变体(EsGnRH1-12),与空白对照组相比GVBD比例并没有显著性差异(P>0.05),说明肽段末端添加的G对EsGnRH活性并无影响。这些实验不仅证实中华绒螯蟹GnRH具有与脊椎动物相似功能,同时表明在甲壳动物中确实存在脑-性腺调控通路,通过 GnRH参与卵母细胞最终成熟过程调控,促进GVBD发生。

目录

摘要

ABSTRACT

目录

引言

1. GnRH 的发现

2. 脊椎动物 GnRH 研究进展

2.1 脊椎动物 GnRH 家族

2.2 脊椎动物 GnRH 分类

3. 无脊椎动物 GnRH 研究进展

3.1 脊索动物的 GnRH

3.2 非脊索动物的 GnRH

4. 甲壳类动物 GnRH 研究意义

第一章 中华绒螯蟹促性腺释放激素类似物分离技术建立与优化

1. 前言

2. 材料和方法

2.1 实验动物

2.2 中华绒螯蟹脑组织粗提液制备

2.3 蟹脑组织粗提液的 RP-HPLC 分离

2.4 斑点免疫鉴定实

2.5 基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱测定分子量

3. 实验结果

3.1 蟹脑组织粗提液免疫鉴定

3.2 蟹脑粗提液 RP-HPLC 分级分离及免疫鉴定

4. 讨论

第二章 中华绒螯蟹促性腺释放激素类似物分级分离与结构鉴定

1. 引言

2. 材料方法

3. 实验结果

3.1 RP-HPLC 方法制备含有 GnRH 类似物的初次分离组分

3.2 制备的初次分离组分 RP-HPLC 分离及免疫鉴定

3.3 GnRH 类似物获得及免疫鉴定

3.4 GnRH 类似物纯度及含量鉴定

3.5 GnRH 类似物分子量测定

3.6 串联质谱测定 GnRH 类似物氨基酸序列

3.7 GnRH 类似物氨基酸结构验证

3.8 中华绒螯蟹 GnRH 类似物氨基酸序列比对

4. 讨论

第三章 GnRH 在中华绒螯蟹脑组织的免疫组化定位

引言

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 组织学与免疫组化化学实验

2. 实验结果

3. 讨论

第四章 中华绒螯蟹 GnRH 类似物促卵母细胞最终成熟作用

引言

1. 不同浓度 GnRH 类似物促卵母细胞最终成熟作用

1.1 材料与方法

1.2 分组实验

1.3 观察与统计

1.4 实验结果

2. 中华绒螯蟹两种 GnRH 类似物亚型之间协同作用

2.1 实验多肽注射溶液配制

2.2 实验分组

2.3 观察与统计

2.4 实验结果

3. 中华绒螯蟹 GnRH 突变体促卵母细胞最终成熟作用

3.1 人工合成多肽激素

3.2 多肽注射溶液配制

3.3 实验分组

3.4 观察与统计

3.5 实验结果

4. 讨论

小结

参考文献

附录

致谢