黄喉拟水龟CCL20基因序列特征及表达分析

摘要

利用本实验室构建的黄喉拟水龟SMART全长cDNA文库,筛选得到巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaMIP-3α或 MaCCL20)全长cDNA序列,Maccl20基因 cDNA全长2318 bp,5’非编码区(Untranslated region，UTR)长1525 bp,3’UTR长532 bp,开放阅读框(Open reading frame，ORF)为261 bp,编码86个氨基酸组成的多肽链,分子量为9.739 kDa,理论等电点为9.004。综合亲水性表面可及性以及抗原指数三项指标,预测可形成抗原表位的氨基酸区域数为7。同源性分析表明,黄喉拟水龟与变色蜥(Anolis carolinensis)、原鸡(Gallus gallus)的巨噬细胞炎症蛋白-3α亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示:MaMIP-3α在肝脏、肾脏、心脏、脾脏中均有表达,脾脏中表达量最高。
　　根据黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(Mauremys mutica Cantor Macrophage inflammatory protein3α,MaMIP-3α或 MaCCL20)的cDNA全长设计特异性引物,然后采用PCR克隆技术从黄喉拟水龟的肝脏组织中克隆出 MaMIP-3α的成熟肽的基因序列。将得到的成熟肽序列插入到 PMD18-T克隆载体上,转化进大肠杆菌E.coli DH5α中,得到的质粒经PCR以及测序鉴定正确后,将双酶切目的片段插入到表达载体 pET-32a上,构建成原核表达重组质粒 pET-32a-CCL20并将表达质粒转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后成功表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白。以该融合蛋白为抗原制备了多克隆抗体。经过测序分析表明,MaCCL20的成熟太基因序列成功的插入到表达载体Pet-32a中。经过IPTG诱导表达、SDS-PAGE凝胶电泳和Western bolt分析显示,所表达的融合蛋白的相对分子质量约为30KD,与目的蛋白大小一致并且与带 His标签的单克隆抗体发生特异性反应。经 His Bind镍柱纯化后 SDS-PAGE凝胶电泳检测出现单一条带。实验结果表明成功的获得了黄喉拟水龟 MaCCL20的多克隆抗体。为建立检测黄喉拟水龟内源性 MaCCL20的免疫检测法、酶联免疫吸附法、放射性免疫法等奠定了基础,为后续探索巨噬细胞炎症蛋白-3α在黄喉拟水龟的非特异性免疫反应中作用提供了一些重要的信息。

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第一章 引 言

1 黄喉拟水龟简介

2 龟类防病机制

3 黏质沙雷氏菌

4 CCL20 基因研究进展

5 研究目的意义及技术路线

第二章 黄喉拟水龟 CCL20 基因序列特征与组织表达分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 黄喉拟水龟 CCL20 重组表达及 Western blot 分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

总结

参考文献

硕士期间完成文章

附录 A 实验所用引物序列及作用

附录 B 主要仪器设备

附录 C 试剂及缓冲液的配置

附录 D 缩略语表

附录 E pET-32a 载体图

致谢