对虾白斑综合征病毒(WSSV)VP12、VP14、VP51、VP136C与病毒及宿主蛋白的相互作用

摘要

对虾白斑综合征病毒(WSSV)是对虾重要的致病原,从开始发病的2到5天内会导致对虾100％的死亡率。病毒的结构蛋白在靶定细胞、病毒入侵、组装、复制和引起宿主抗病毒反应的过程中起重要作用,因此分析病毒蛋白的功能对于了解WSSV的侵染机制和致病机理,寻找有效防止WSSV的感染方法具有重要作用。
　　研究内容及结果如下:
　　第一部分:VP12是囊膜蛋白,对应中国株ORF432,编码102氨基酸,理论分子量为12kDa。根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp12(wsv432)的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp12基因,构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp12并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小19kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法,获得纯化VP12蛋白,制备兔抗VP12的抗体。
　　提取感染WSSV不同时刻的对虾鳃组织的RNA,利用RT-PCR技术分析发现VP12是感染早期表达的基因。用FITC标记的VP12与对虾血淋巴细胞作用,结果表明VP12能够粘附到细胞表面。
　　用地高辛标记VP12,采用Far-western blot、ELISA,分析VP12与WSSV结构蛋白的作用,结果表明,VP12与囊膜蛋白 VP24、VP26具有相互作用;分析VP12与对虾鳃细胞膜蛋白的作用,筛选出一个鳃膜蛋白与VP12具有结合作用,经质谱分析为腺嘌呤核苷转移酶(LvANT).
　　第二部分:用已有的重组菌株,37℃用L-阿拉伯糖诱导,以Co2+亲和层析方法,获得纯化LvANT蛋白,制备兔抗LvANT的抗体。
　　Far-western blot、ELISA分析表明重组的VP12和LvANT具有结合作用。间接免疫荧光结果表明 VP12与LvANT共定位于细胞表面; RT-PCR分析表明, LvANT在对虾血淋巴、鳃组织、肌肉、类淋巴、肝胰腺、胃、肠组织中都有表达;细胞定位实验表明LvANT主要定位在血细胞的表面和细胞质内;体外中和试验发现,LvANT在感染的早期能够延迟WSSV的侵染。
　　第三部分:根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp14的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp14基因,构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp14并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小15kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法,获得纯化VP14蛋白,制备鼠抗VP14的抗体。
　　间接免疫荧光试验表明VP14能够粘附到对虾血细胞表面。质谱分析显示VP14与VP26,VP28有结合作用;采用Far-western blot证明 VP14与VP26、VP28C、VP37和VP39具有结合作用。将VP14与对虾鳃细胞膜蛋白作用,筛选出一个鳃膜蛋白,经质谱分析为精氨酸激酶(LvAK)。
　　第四部分:根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因LvAK序列,设计并合成引物,PCR扩增得到LvAK基因,构建重组表达载体pBAD/gIIIA–AK并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小45kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法,获得纯化LvAK蛋白,制备兔抗LvAK的抗体。
　　Far-western blot、ELISA进一步表明重组的LvAK和VP14具有结合作用,间接免疫荧光结果表明VP14与LvAK共定位于细胞表面;转录分析表明,LvAK在对虾血淋巴、鳃组织、肌肉、类淋巴、肝胰腺和肠中都有分布,在肌肉中的表达量最大;细胞定位实验表明 LvAK主要定位在血细胞的表面和细胞质内,细胞核内几乎没有;Real-time PCR分析表明,当对虾受到WSSV攻击时,血淋巴、肌肉中的LvAK的表达量会迅速发生变化,表明LvAK与WSSV感染密切相关。
　　第五部分:根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp51的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp51基因,构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp51并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小55kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法,获得纯化VP51蛋白。Far-western blot实验表明VP51与对虾鳃膜蛋白的LvANT、LvRPL7有作用。
　　第六部分:根据GeneBank上公布的LvRPL7的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到 LvRPL7基因,构建重组表达载体 pBAD/gIIIA–RPL7并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用 L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小37kDa相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法,获得纯化LvRPL7蛋白,制备兔抗LvRPL7的抗体。
　　Far-western blot、ELISA分析进一步表明重组的LvRPL7和VP51具有结合作用。RT-PCR分析显示,LvRPL7的mRNA在对虾血淋巴、鳃组织、肌肉、类淋巴、肝胰腺和肠中都有转录表达,在肌肉中的表达量最大,其次是鳃组织;细胞定位实验表明 LvRPL7主要定位在血细胞的表面和细胞质内,细胞核内几乎没有;Real-time PCR分析表明,当对虾受到WSSV攻击时,肌肉和肝胰腺中的LvRPL7的表达量会迅速发生变化,表明LvRPL7与WSSV感染密切相关。
　　第七部分:VP136是WSSV核衣壳蛋白, VP136C是VP136 C-端含RGD序列的部分片断,编码373个氨基酸,理论分子量为40KD。根据GeneBank上WSSV囊膜蛋白基因vp136C的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp136C基因,构建重组表达载体pBAD/gIIIA–vp136C并转化大肠杆菌Top10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小45kDa相符合的目的蛋白。以 Co2+亲和层析方法,获得纯化VP136C蛋白。
　　用FITC标记的VP136C与对虾血淋巴细胞作用,VP136C能够粘附到细胞表面。采用Far-western blot、ELISA方法,分析VP136C与WSSV结构蛋白的作用,结果表明,VP136C与囊膜蛋白VP26具有相互作用;分析VP136C与对虾鳃细胞膜蛋白的作用,发现VP136C能与血蓝蛋白、肌动蛋白、LvANT和F0-ATP synthase b链结合。

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引言

第一章VP12的原核表达及功能分析

第一节VP12的重组表达

第二节VP12与对虾血淋巴细胞的作用及中和试验

第三节VP12与WSSV几种结构蛋白之间的作用

第四节VP12与凡纳滨对虾鳃膜蛋白之间的作用

第二章凡纳滨对虾LvANT的表达及与WSSV作用

第一节凡纳滨对虾LvANT的原核表达及抗体制备

第二节ANT的组织分布及与VP12的相互作用

第三章VP14的原核表达及功能分析

第一节VP14的重组表达与抗体制备

第二节VP14与WSSV结构蛋白及对虾鳃细胞膜蛋白的相互作用

第四章 凡纳滨对虾AK的表达及与WSSV作用

第一节 凡纳滨对虾AK的原核表达与抗体制备

第二节AK与WSSV蛋白作用

第三节 AK组织分布及WSSV感染对AK mRNA表达量的影响

第一节VP51的重组表达

第二节 VP51与对虾鳃细胞膜蛋白的相互作用

第六章 凡纳滨对虾RPL7的表达及与WSSV作用

第一节 凡纳滨对虾RPL7的原核表达与抗体制备

第二节RPL7组织分布及WSSV感染对RPL7 mRNA表达量的影响

第七章VP136C的原核表达及功能分析

第一节VP136C的原核表达

第二节VP136C与WSSV结构蛋白及对虾鳃膜蛋白间的作用

小结

参考文献

附录

致谢