番石榴叶对斑节对虾免疫功能的影响及其抗WSSV有效成分初探

摘要

白斑综合征（WSS）自1988年首次发现以来，到2000年几乎席卷世界沿海各国，对全球对虾养殖业造成毁灭性的打击。至目前为止，由于对WSS仍无有效的治疗方法，因此对其进行早期预防就显得极为重要。番石榴叶水提取物可以有效地消除海水中WSSV的感染活性，具备开发成为针对WSSV水体消毒剂的可能性。为了确定其在对虾养殖中使用的可行性，本文进行了以下三个方面的研究：
　　首先，在基础饲料中添加六种比例的番石榴叶(0％、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%，分别标记为G0、G1、G2、G3、G4、G5)饲喂斑节对虾(体重为1.576±0.011 g)56天，研究番石榴叶对斑节对虾生长和非特异性免疫功能的影响，评价番石榴叶在对虾养殖中作为水体消毒剂使用的安全性。结果表明：试验组斑节对虾增重率均显著高于对照组（P<0.05），其中G1组增重率最高，达到308.44%。饲料中添加番石榴叶投喂斑节对虾可以提高对虾血清和肝胰腺中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合成酶（NOS）和溶菌酶（LSZ）的活力。其中血清中 PO、SOD，肝胰腺 SOD、ACP、AKP均在G1组最高，达到7.50U/ml、178.33 U/ml、57.32 U/g protein、32.67kim unit/g protein、27.10kim unit/g protein，除血清SOD外，均显著高于对照组（P<0.05），后随着番石榴叶添加比例的增加而降低。血清ACP、AKP、LSZ和肝胰腺LSZ活力随着番石榴叶添加比例的增加而增高，在G3组最高，达到6.79 kim unit/100ml、11.66 kim unit/100ml、53.95 U/ml和3459.95 U/mg protein，且均显著高于对照组（P<0.05），后随着添加比例的增加而降低。血清 TNOS活力随着番石榴叶添加比例的增加而增高，在G4组最高，显著高于对照组（P<0.05），达到64.80 U/ml，后随着添加比例的增加而降低。因此，在对虾饲料中添加番石榴叶投喂斑节对虾，不仅可以促进斑节对虾生长，还可以提高对虾的免疫机能，可以认为作为水体消毒剂使用对对虾不存在负面影响，是安全的。
　　其次，为了探讨番石榴叶除了消除水体中WSSV的感染活性外，是否可以杀灭对虾体内的病毒，从而可以在饲料中使用的可行性，研究了番石榴叶在饲料中使用对斑节对虾抗白斑综合征病毒（WSSV）的影响，包括以下两个方面的内容：1、对人工感染 WSSV的对虾投喂含不同浓度（0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%）番石榴叶的饲料，在试验过程中观察死亡情况，观察治疗效果；2、对连续饲喂添加不同浓度（0%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%）番石榴叶3d、6d、12d、24d的对虾分别进行人工感染WSSV，统计累计死亡率，观察预防效果。结果显示：治疗试验中饲喂含番石榴叶饲料的试验组半数死亡时间均早于对照组；预防试验中添加番石榴叶浓度为0.05%、连续饲喂6d或添加番石榴叶浓度为0.025%，连续饲喂12d，对虾的半数死亡时间出现均比对照组晚。表明：对虾感染 WSSV后再饲喂番石榴叶，番石榴叶对已感染斑节对虾治疗作用不明显；而对虾先饲喂番石榴叶后人工感染 WSSV，可明显提高对虾的抗病力，且番石榴叶的添加浓度和投喂时间长短对斑节对虾抗 WSSV的能力均有影响，添加番石榴叶浓度为0.025%、连续饲喂12d和添加番石榴叶0.05%，连续饲喂6d，斑节对虾抗病力均可明显提高。
　　最后，本实验利用有机萃取技术，对番石榴叶水提取物进行了初步分离，得到石油醚相(S)、乙酸乙酯相(Y)、正丁醇相(Z)和水相(W)四个组分。然后，通过人工感染实验，确定了各组分抗WSSV的效果，并通过体外实验研究了番石榴叶水提取物及各组分对WSSV的影响。人工感染的结果显示：用乙酸乙酯相与正丁醇相这两种组分分别处理WSSV后，对虾在用WSSV人工感染后未出现死亡，而用石油醚组分处理WSSV后，对虾在用WSSV人工感染后的第5天开始出现死亡，第12天时全部死亡，表明番石榴叶中影响WSSV致病性的有效成分的极性较强。用番石榴叶水提取液及其各萃取组分体外处理WSSV不同时间后，试验组和对照组中的病毒拷贝数随时间推移略有降低，但在第120h结束时，各组中的病毒拷贝数还维持在较高水平；之后，将WSSV核酸暴露，并在体外用番石榴叶水提取物及其各萃取组分处理，荧光定量PCR结果显示：随着孵育时间的延长，各组病毒基因拷贝数无显著性变化（P>0.05）。

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引言

第一章 文献综述

1对虾白斑综合征病毒研究概况

1.1 对虾白斑综合征病毒的发现及命名

1.2 对虾白斑综合征的症状

1.3 WSSV的形态和结构

1.4 WSSV的宿主范围和传播途径

1.5 理化因子对wssv的活性的影响

1.6对虾白斑综合征防治研究

2番石榴叶药用的研究概况

2.1番石榴叶简介

2.2番石榴叶化学成分研究

2.3番石榴叶的药理作用

2.4番石榴叶的毒性

3甲壳动物的免疫系统

3.1器官免疫

3.2 细胞免疫

3.3体液免疫

第二章 番石榴叶对斑节对虾生长和非特异性免疫功能的影响

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验饲料的制备

1.3试验对象管理

1.4 养殖实验样品采集

1.5免疫因子活力测定

1.6数据处理方法

2.结果与分析

2.1番石榴叶对斑节对虾生长性能的影响

2.2斑节对虾饲喂番石榴叶后免疫酶指标的活性检测

3讨论

第三章 番石榴叶对斑节对虾抗WSSV能力的影响

1材料和方法

1.1 实验材料

1.2试验饲料的制备

1.3试验对象管理

1.4 WSSV的检测

1.5WSSV感染病毒液的制备

1.6 WSSV对斑节对虾人工感染注射浓度

1.7分组及观察

2结果与分析

2.1WSSV的检测

2.2治疗实验

2.3预防实验

3讨论

第四章 番石榴叶水提取物抗WSSV有效成分初探

1材料和方法

1.1实验材料

1.2番石榴叶提取液的制备

1.3 对虾养殖

1.4 番石榴叶水提取物的萃取分离

1.5病料中WSSV的实时定量PCR检测

1.6 WSSV感染病毒液的制备

1.7 WSSV注射浓度的确定

1.8药液的制备

1.9人工感染试验

1.10 番石榴叶水提取物及各萃取组分对WSSV的影响（体外）

1.11 番石榴叶水提取物及各萃取组分对WSSV核酸的影响（体外）

2结果和分析

2.1 WSSV的实时定量PCR检测

2.2番石榴叶水提取物的萃取分离

2.3 WSSV的注射浓度的确定

2.4 番石榴叶水提取物及各萃取组分对WSSV感染活性的影响

2.5番石榴叶水提取液及各萃取组分对WSSV的影响（体外）

3讨论

全文总结

参考文献

附录

专利及发表的文章

致谢