基于γ-氨基丁酸A型受体的鱼类受渔药影响的研究

摘要

γ-氨基丁酸（Gama-Aminobutiric acid, GABA）是机体内一种主要的抑制性神经递质，主要在中枢神经系统中分布。在体内，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD）作用下，不可逆的脱去α位上的羧基形成GABA，生成的GABA在GABA转氨酶（GABA transaminase, GABA-T）催化作用下生成琥珀酸半醛。其中GAD存在GAD65和GAD67两种同工酶。
　　γ-氨基丁酸受体（GABA receptor，GABAR）是指突触膜上能识别和结合GABA的部位，当GABA与其结合后，细胞膜离子通透性发生改变，从而引起神经发生抑制。GABAR根据对激动剂和抑制剂的敏感性不同分为GABAAR（ARs）、GABABR（BRs）和GABACR（CRs）三个亚型。GABAAR是由膜蛋白组成的五聚体，为离子通道型受体，其中α1β2γ2是ARs最主要的一种亚型，且每个α1β2γ2亚型中均含有2个α1和β2亚基。
　　目前，关于淡水鱼类GABAAR以及渔药对GABAAR的影响等研究还未见有相关报道。异育银鲫为我国广泛养殖的大宗淡水鱼类之一；因此，本文以异育银鲫为研究对象，采用RT-PCR、qPCR以及HPLC等方法研究了异育银鲫体内GABAAR、GABA合成代谢酶的组织分布特点，并进行了基于GABAA受体的鱼类受阿维菌素及双氟沙星影响的研究。
　　第一部分异育银鲫体内GABAA受体及其GABA相关合成代谢酶研究
　　以异育银鲫为研究对象，首先运用RT-PCR分析了GABAA受体β2亚基（ARβ2）的a、b亚型在异育银鲫体内的分布情况。结果显示在异育银鲫中枢神经系统（端脑、中脑、小脑、延脑）和外周神经组织（肝脏、肾脏、心脏、肠道、鳔、鳃、肌肉及鳍条）均有A型GABA受体β2亚基a、b亚型（ARβ2a和ARβ2b） mRNA表达；另外，GAD65、GAD67和GABA-T在上述组织中均有表达。
　　其次运用荧光定量PCR方法对异育银鲫不同组织中ARβ2a、ARβ2b、GAD和GABA-T基因mRNA的表达情况进行了定量研究。结果发现ARβ2a、 ARβ2b、GAD和GABA-T mRNA主要在大脑组织中表达，外周组织表达极少；但是GABA-T除了在大脑中大量表达之外，还在外周组织特别是肝脏组织中有相当一部分的GABA-T表达。另外，研究不同发育阶段对受体表达的影响结果显示，当异育银鲫体重发生变化时，组织中的ARβ2a、ARβ2b的表达也发生了改变。
　　第二部分基于GABAA受体的异育银鲫受阿维菌素类药物影响研究
　　阿维菌素（Avermectin，AVM）是水产养殖上广泛使用的寄生虫防治药物之一。为了研究基于GABAA受体的阿维菌素类药物对鱼类的影响，本文首先测定了AVM对异育银鲫急性毒性以及不同浓度下各组织中AVM残留情况。结果显示：AVM对体重为60.04±5.02 g的异育银鲫24 h、48 h和96 h半数致死浓度（LC50）分别为0.127、0.071和0.039 mg/L，因此推算得到AVM安全浓度（SC）为0.0039 mg/L。AVM组织残留结果显示，AVM按照24 h、48 h及96 h半数致死浓度（0.127、0.071、0.039 mg/L）及安全浓度（0.0039 mg/L）泼洒用药后，均能从异育银鲫大脑组织中检测出有AVM残留，且大脑中AVM残留量与用药浓度呈正相关，其中24 h LC50浓度下大脑中AVM含量最高为0.292±0.005μg/g。结果表明，在上述用药浓度下，AVM均能渗透血脑屏障进入异育银鲫大脑。
　　AVM用药后对异育银鲫ARβ2亚基影响结果显示，AVM按照24 h LC50、48 h LC50、96 h LC50及安全浓度（0.127、0.071、0.039、0.0039 mg?L-1）泼洒用药后，中枢神经系统中的端脑、中脑、小脑、延脑四种组织中ARβ2a和ARβ2b mRNA在不同用药浓度及不同时间点，均表现为极显著下调，且延脑是ARβ2a和ARβ2b mRNA表达下调最为明显的组织。而外周组织中，肝脏、肾脏组织中ARβ2a mRNA表达显著上调，而肌肉组织中ARβ2a mRNA显著下调；而ARβ2b除肾脏组织在24h（96 h LC50）时间点上显著上调之外，肝脏、肾脏、肌肉三种组织ARβ2b mRNA表达均表现为极显著下调。且结果显示，肝脏、肾脏、肌肉三种外周组织中ARβ2a和ARβ2b mRNA表达的上、下调幅度与AVM用药浓度无关。上述结果表明AVM用药后，异育银鲫体内ARβ2mRNA表达量呈下降趋势。
　　另外，结果显示AVM用药后对异育银鲫GAD、GABA-T基因mRNA表达也产生了影响。GAD方面，AVM根据上述浓度泼洒用药后，大脑组织中，端脑、中脑、小脑和延脑四种组织中的GAD65和GAD67 mRNA表达均表现为极显著下调，且延脑是GAD65和GAD67 mRNA下调最为明显的组织。而在外周组织中，除了24h（96h LC50）时间点上GAD65和GAD67 mRNA表达显著上调之外，肝脏、肾脏、肌肉三种外周组织中的GAD65和GAD67 mRNA在不同用药浓度及不同时间点上均表现为极显著下调，其中肌肉组织为GAD65和GAD67 mRNA表达下调最为显著的外周组织。GABA-T方面，AVM在上述用药浓度条件下，端脑、中脑、小脑延脑四种大脑组织中的GABA-T mRNA表达均显著下调；外周组织中除了肾脏组织在24h（96 h LC50）时GABA-T mRNA表达显著上调之外（1.32±0.07倍），其余均表现为极显著下调。AVM用药后对异育银鲫GAD、GABA-T基因mRNA表达影响的结果总体表明AVM用药后，异育银鲫体内GABA的合成及代谢均是减缓的。
　　第三部分基于GABAA受体的异育银鲫受氟喹诺酮类药物影响研究
　　同样，为了研究基于GABAA受体的异育银鲫受氟喹诺酮类药物的影响，本文首先测定了DIF（其中一种氟喹诺酮类药物）对异育银鲫急性毒性以及不同剂量条件下各组织中DIF组织残留情况。结果显示：DIF对体重为60.04±5.02 g的异育银鲫在单次前肠投喂方式给药条件下96 h半数致死剂量（LD50）为2840 mg/kg，根据渔药毒性分级标准判断其为低毒物质。DIF组织残留方面，异育银鲫大脑组织在96 h LD50第96h时及临床用药剂量上限（20 mg/kg）的24个时间点上均能检测出DIF的存在，说明DIF渗透通过异育银鲫BBB而进入其大脑组织。另外，DIF采用临床用药剂量上限（20 mg/kg）给药后，大脑、肝脏、肾脏及肌肉四种组织中以大脑组织中的药物消除过程最为平缓；且到试验第960 h，大脑组织中DIF含量最高（0.392±0.007μg/g）。因此可以推测异育银鲫大脑组织可以作为DIF药物残留分析的靶组织。
　　DIF用药后对异育银鲫ARβ2亚基影响方面，DIF在96 h LD50及20 mg/kg用药条件下，端脑、中脑、小脑、延脑组织中的ARβ2a mRNA的表达均极显著下调；对ARβ2b mRNA的表达除了延脑20 mg/kg用药条件下表达下调之外，端脑、中脑、小脑中的表达均上调。其中端脑是鱼类高级运动中枢，由此可以推测 DIF所引起的神经兴奋可能是通过对ARβ2b mRNA的表达的上调实现的。外周组织中，肝脏、肾脏和肌肉中ARβ2a和ARβ2b mRNA表达均极显著上调，其中以对肌肉组织中的表达影响最为明显。上述结果表明DIF用药后，异育银鲫体内ARβ2 mRNA表达量总体呈增加趋势。
　　对异育银鲫GAD基因影响方面，脑组织在DIF（96 h LD50）用药条件下，端脑、中脑、小脑、延脑组织中GAD65和GAD67 mRNA的表达显著上调或者极显著上调；而20 mg/kg用药下，DIF对GAD65和GAD67 mRNA的表达均下调。由此可以推论：在96 h LD50用药条件下，大脑中的GABA的合成量是增加的，而在20 mg/kg用药下各个时间点GABA的合成减少的。DIF对异育银鲫GABA-T基因影响方面，在96 h LD50用药条件下，端脑、中脑、小脑、延脑、肝脏、肾脏和肌肉组织中GABA-T mRNA的表达均极显著上调。结果表明在96 h LD50 DIF用药条件下，上述各组织中GABA的代谢是极显著加强的。
　　综上，研究发现ARβ2（a、b亚型）、GAD及GABA-T在异育银鲫中枢神经系统的端脑、中脑、小脑、延脑和外周神经组织的肝脏、肾脏、心脏、肠道、鳔、鳃、肌肉及鳍条等12部位均有分布，且上述基因的表达均主要集中在中枢神经系统中。基于GABAA受体的鱼类受药物影响结果表明，阿维菌素及双氟沙星绝大多数情况下能对受体的下调表达影响。同样AVM、DIF用药后对异育银鲫体内GAD及GABA-T也能产生影响，但二者所产生的影响难以对机体内GABA含量变化加以判断。

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引言

第一章 文献综述

1.1γ-氨基丁酸

1.2γ-氨基丁酸受体

1.3 阿维菌素类药物研究进展

1.4 氟喹诺酮类药物研究进展

1.5 本文目的和意义

1.6 本文主要内容

第二章 异育银鲫体内GABAA受体及GABA合成代谢酶研究

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4小 结

第三章 基于GABAA受体的阿维菌素对异育银鲫影响研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4小 结

第四章 基于GABAA受体的氟喹诺酮类药物对异育银鲫影响研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4小结

全 文 结 论

创 新 点

参考文献

附录A 缩略词表

附录B 各基因引物目的序列与测序序列比对结果

附录C 各基因荧光定量标准及熔解曲线

附录D 攻读学位期间发表的与学位论文相关的学术文章

致谢