草鱼3种丙酮酸激酶和α-淀粉酶基因的结构、表达分析和生长相关标记筛选

摘要

饲料中的糖类物质是成本较低的供能物质，但与哺乳动物相比，鱼类对糖的利用率是较低的。本研究选取了鱼类糖利用关键酶中的丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）和α-淀粉酶（α-amylase，AMY）作为研究对象，分析了PK基因和AMY基因的cDNA序列，组织表达特征以及早期发育的表达谱，并将编码这两种酶的基因作为筛选草鱼生长相关SNPs的候选基因，以期对草鱼饲料中糖类物质的合理添加量提供一定的指导，同时为草鱼分子标记辅助育种提供更多的标记。具体研究内容如下：
　　1.草鱼三种丙酮酸激酶基因的cDNA序列分析、组织表达特征和早期发育的表达谱。cDNA序列分析结果显示：草鱼的PKL基因ORF长1617bp，编码538个氨基酸；PKMb基因ORF长1587bp，编码528个氨基酸；PK-like基因ORF长1599bp，编码532个氨基酸。应用实时定量PCR(real-time PCR)检测了草鱼三种类型的丙酮酸激酶基因PKL、PKMb和PK-like在不同组织和早期发育不同时期的相对表达量。组织表达定量分析结果显示：PKL主要在肝脏、前肠、中肠和肾脏中表达，PKMb在肌肉中表达量最高，而PK-like在心脏中表达量最高。氨基酸序列同源性比对发现草鱼的PKL和PKMb分别与斑马鱼的肝脏型PK、肌肉b型PK同源性最高，分别为90％和93%，且主要表达部位相同，关键活性位点与斑马鱼的L和肌肉b型均保守,故确定PKL与PKMb分别为草鱼的肝脏型和肌肉型PK同工酶。而PK-like与斑马鱼的肌肉a型PK同源性最高为95%，但主要表达部位确是心脏，与大鼠的PKM1型同源性最高，但关键活性位点却不保守，故PK-like的同工酶类型还有待进一步的验证。
　　早期发育定量分析结果显示：PKMb和PK-like在未受精卵中就有大量的表达，而PKL从原肠晚期才开始表达，从未受精卵到出膜后48小时，PKMb和PK-like的表达量都高于PKL；而出膜后72小时，PKL的表达量明显上升。推测在草鱼的早期发育阶段，PKMb和PK-like是胚胎仅以卵黄为营养来源即出膜72小时开口摄食之前在糖酵解过程中起主要作用的PK同工酶类型，仔鱼开口摄食之后，PKL的表达量显著上调（P<0.05）。
　　2.草鱼PK-like与PKL基因SNP位点与生长性状的关联分析。根据草鱼EST库的PK-like与PKL重叠群的Contig设计了3对引物，采用直接测序法和序列比对，在PK-like基因上共筛到2个SNP位点：H3(T+1819C)，H4(G+1820T)。采用SnaPshot的方法对2个位点在3个群体中的基因型分布进行检测，发现这两个位点完全连锁，H3和H4位点组成了3种基因型（AA、AB和BB）。利用一般线性模型分析2个SNP位点与草鱼随机群体重要生长性状的关系的结果显示:杂合基因型的AB的增重率分别比AA和BB快0.6%和3.4%，不同基因型在统计上与草鱼随机群体中与生长性状（体质量、体长、体宽）均没有显著关联性（P>0.05）。在投喂两种不同糖水平（普通：39.4%，高糖：45.4%）饲料的两个草鱼群体中：对于投喂普通糖水平饲料的群体，AA型增重率分别比AB型和BB型快4.9%和6.1%，但在统计上不同基因型的体质量均没有显著差异（P>0.05）。而在饲喂高糖饲料的群体中，基因型AA的体质量显著大于AB型和BB型（P<0.05），AB型和BB型无之间无显著差异（P>0.05）。AA型的增重率分别比AB型和BB型快36.8%和30.4%，且与在AB型和BB型中高糖群体的增重率小于普通糖群体不同，在AA型中，高糖群体的增重率比普通糖群体的增重率快11.4%，说明具有基因型AA草鱼的生长速度在高糖条件下比在低糖时更快，推测具有基因型AA的草鱼能更好地利用饲料中的糖。
　　在基因PKL上筛选到了3个SNP位点：H5(T+561C)、H6(T+744C)、H7(A+762G)。采用SnaPshot的方法对3个位点在3个群体中的基因型分布进行检测，发现H5(T+561C)和H7(A+762G)完全连锁，组成了3种基因型（AA、AB和BB）。将这3个位点的不同基因型在草鱼随机群体中进行与生长性状（体质量、体长、体宽）的关联分析，结果显示：H5和H7组成的AA型的增重率分别比AB和BB型快6.4%和9.2%，对于位点H6(T+744C)，TT型的增重率分别比TC型和CC型的快9.0%和11.0%，但这3个位点的不同基因型在统计上与生长均没有显著关联性（P>0.05）。在投喂两种不同糖水平饲料的两个草鱼群体中：H5(T+561C)和H7(A+762G)两个位点的不同基因型在2个群体的体质量上均无显著差异（P>0.05），但在普通群体中AA型的增重率分别比AB型和BB型快15.7%和7.2%，在高糖群体中AA型的增重率分别比AB型和BB型快17.4%和11.2%。对于位点H6(T+744C)，在投喂普通糖水平群体中，基因型TT的体质量显著大于基因型TC(P<0.05)，但与基因型CC又无显著差异（P>0.05），基因型TT的增重率分别比TC型和CC型快32.0%和21.2%。在高糖群体中，不同的基因型之间无显著差异（P>0.05）。本研究中在质量均大于900g的草鱼随机群体中H6位点与生长没有显著关联性，而在体质量均小于142.5g的普通糖水平的群体中与生长有显著关联性。推测相同的SNPs位点对草鱼生长的影响可能与草鱼的生长阶段有关。
　　3.草鱼α- AMY基因cDNA序列分析、组织表达特征和早期发育的表达谱。cDNA序列分析结果显示：草鱼的α-AMY的ORF框长1539bp,编码512个氨基酸，氨基酸同源性比对发现草鱼α-AMY与其它物种的同源性很高，且在关键活性位点处均保守，其中与斑马鱼（Danio rerio）α- AMY氨基酸的同源性最高，为92%。应用实时定量PCR(real-time PCR)检测了草鱼α- AMY基因在不同组织和早期发育不同时期的相对表达量。组织表达定量分析结果显示：草鱼α-AMY基因在肝胰脏中的表达量最高，其次是在肠道中。早期发育定量分析结果显示：从器官形成期才开始检测到α-AMY的表达，一直到出膜后48h表达都很微弱，出膜后72h之后表达量升高较明显。对组织分布和早期发育的定量研究结果分析表明：草鱼的肝胰脏和肠道中均有α- AMY的合成；仔鱼开口摄食（出膜后72h）之后α- AMY的表达明显升高，其中出膜后120h和出膜后144h的表达量分别是刚开口摄食时的4.5倍和32.0倍，这对草鱼早期发育阶段饲料中淀粉的添加量提供了一定的指导。
　　4.草鱼α-AMY基因SNP位点与生长性状的关联分析。在α-淀粉酶基因上共筛到2个SNP位点：H1(T+357A)、H2(T7A)。利用一般线性模型分析2个 SNP位点在3个群体中与草鱼体质量、体长等重要生长性状的关系的结果显示：在随机群体中，两个位点的不同基因型在体质量、体长等主要生长性状上差异均不显著（P>0.05）,但H1位点的AA型的增重率分别比AT和TT型的快0.4%和1.3%；H2(T7A)位点TT型的增重率比AA型快3.1%。在投喂两种不同糖水平的两个草鱼群体中与体质量均无显著关联性（P>0.05）。但从两个群体的体质量均值，我们可以发现高糖对草鱼的生长产生了影响，因为对于同一种基因型投喂高糖饲料的群体的体质量均值均小于投喂普通糖水平饲料的体质量均值，说明饲料中的糖添加量过多会抑制草鱼的生长。

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第一章 引言

1.1鱼类丙酮酸激酶（PK）的研究进展

1.2鱼类α-淀粉酶的研究进展

1.3鱼类生长性状相关SNP分子标记的研究进展

1.4草鱼研究简介

1.5小结

1.6本研究的目的与意义

第二章 草鱼3种丙酮酸激酶基因的结构和表达特征

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论

第三章 草鱼2种丙酮酸激酶基因SNP筛选及生长关联分析

3.1 2 种丙酮酸激酶基因SNP在随机群体中与生长的关联分析

3.2 2种丙酮酸激酶基因在不同糖水平下与生长的关联分析

3.3讨论

第四章 草鱼α-淀粉酶基因的结构和表达特征

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 草鱼α-淀粉酶基因SNP筛选及其与生长的关联分析

5.1 α-淀粉酶基因SNP在随机群体中与生长的关联分析

5.2 α-淀粉酶基因SNP在不同糖水平下与生长的关联分析

5.3讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文