来源于Halopiger xanaduensis 的木聚糖酶基因在毕赤酵母中诱导表达及其酶学性质的研究

摘要

木聚糖是一种天然的多糖，是纤维素的主要成分，在日常的生活中也比较常见的多糖，在农作物如玉米芯中，玉米的秸秆等地方均有分布，是一种含量丰富，但是利用率还不是很好的多糖。其化学结构相当复杂，在不同物种中的结构不同，甚至同一植株上的不同部位其结构都是有所差异的。主要是木聚糖丰富的侧链基团，也正是这些侧链基团决定了其功能与结构的多样性，在侧链基团取代的方面我们发现，醚化，酯化，以及一些复合型的衍生物比较多。侧链基团丰富，但其主链具有同源性，即其主链由β-1,4糖苷键连接D-木糖残基而组成，一般情况下其主链的木糖残基越少，支链越多，那么其温度稳定性越差，反之则稳定性越好。木糖的溶解性方面比较特殊，一般情况下，木聚糖是溶于水的，但是有很多木聚糖并不溶于水，而是溶解于醇溶液中。这也是木聚糖分类的依据之一。作为一种天然的多糖，其水解产物的作用也越来越受到重视，特别是其彻底水解而生成的木糖分子，在医疗，食品等行业均有良好的发展前景，并且木聚糖相对易得，价格便宜，通常在一些农作物的下脚料中即可获得，是一种非常合适的生产木糖的原材料。 木聚糖酶是一种糖苷水解酶，以GH10和GH11家族的木聚糖酶较多，也是现在普遍研究较多的。木聚糖酶是一种综合的酶系，主要包括内切β-1,4木聚糖酶，β-1,4木糖苷酶，以及可以使寡聚木糖彻底水解生产木糖的外切β1,4木聚糖酶，其中狭义的木聚糖酶就仅指内切β-1,4木聚糖酶，作为糖苷水解酶家族中的一员，木聚糖酶有着很强的水解木聚糖的能力，在生产生活中的应用十分广泛，如造纸行业，纸张的脱墨行业，医疗行业，食品加工行业等都有应用，甚至在酿酒行业也有其用武之地，但是由于造价高，应用受到了很大方面的限制。 基因工程技术对寻找良好的木聚糖酶野生菌是有利的条件，拿以往的科研工作来看，来源菌株大多是自然突变或者野生菌株，基因工程技术的引用使得可以利用人工的方法进行菌株的突变从而得到突变菌种进而增大产量的目的。 本文实验的目的是筛选出更加优秀的菌株，希望能够通过异源表达的过程提高木聚糖酶的产量，通过真核生物的蛋白修饰作用，其pH与温度的稳定性也能够有所提高。本文的实验方法是通过ICBI数据库查阅资料，将来源于Halopiger xanaduesis的木聚糖酶基因通过 PTDS法人工合成，利用毕赤酵母的密码子偏爱性以及木聚糖酶的蛋白序列构造表达载体。构建的分泌表达载体经过BglⅡ酶切，电击转化到毕赤酵母GS115中，并筛选得到阳性克隆。从最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性以及金属离子和部分化合物对酶的性质的影响等方面做了研究。 实验结果表明：木聚糖酶最大反应速率为219μmol/ min· mg，纯化后酶液浓度为200μg/mL。酶液的Km值为2.2 mg/ml。重组木聚糖酶最适pH值为6.0，pH在4.5-8.0之间酶学性质稳定，酶的最适温度是60℃，在温度为20℃-65℃之间酶学性质稳定，金属离子Mn2+与Cu2+对酶有抑制作用，Fe2+，Cr2+，和化合物SDS、DTT对酶有明显促进作用。

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第一章绪论

1.1木聚糖酶研究进展

1.2木聚糖酶的应用

1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统

1.4 本论文研究的目的与意义

1.5 本实验主要研究内容及方案设计

第二章 重组木聚糖酶基因xynB的合成

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

第三章 木聚糖酶基因在毕赤酵母中异源表达

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 重组木聚糖酶基因在毕赤酵母中的诱导表达及产物鉴定

3.4 结果与分析

第四章 重组木聚糖酶酶学特性的研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3 结果分析

4.4 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

附录

致谢