全氟辛烷磺酸(PFOS)对三角帆蚌抗氧化系统的影响及对细胞凋亡的诱导

摘要

全氟辛烷磺酸（PFOS）是典型的持久性有机污染物（POPs），其水溶性大，生物可利用性高，蓄积能力强及毒性作用广泛等特点，造成了其在环境中的大量分布。包括人类在内的各种生物体内也有较高的蓄积量，其污染形势相当严峻。环境水体是PFOS主要的存在和迁移载体，较高的水-泥分布系数使水体沉积物中的PFOS分布远高于水体本身，底栖生物较水体中上层生物具有更多接触PFOS的机会和更大的暴露量，在PFOS生物圈转移中占有重要地位。故研究底栖生物对PFOS胁迫的毒性响应，对了解水生态系统中PFOS的转移和毒性表现具有重要意义。本实验选用我国各大水系中均有分布的传统淡水育珠蚌——三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）作为实验对象，研究其对不同浓度PFOS胁迫的毒理学响应，以为我国的生态毒理学研究提供基础资料。鳃组织是水生动物的呼吸器官，且对环境的变化相当敏感。肝组织则是PFOS的主要蓄积和毒性靶器官。故本实验将研究的重点集中于鳃组织和肝胰腺，以研究PFOS对三角帆蚌的毒性作用。 PFOS主要的毒性表现与其在机体内造成的氧化压迫和组织损伤密不可分，故本实验以三角帆蚌的生物解毒机制和抗氧化防御系统的应答为中心，分别测定了鳃组织和肝胰腺中的还原型谷胱甘肽（GSH）含量，以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽-S转移酶（GSH-ST）、谷胱甘肽还原酶（GR）、总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）的活性，对其解毒机制和抗氧化防御系统做出了系统的评价。同时对其半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate apecfic protease，Caspase）家族中的Caspase-3和Caspase-9活化程度进行了检测，并利用TUNEL细胞凋亡原位检测对组织中的细胞凋亡现象进行了直观的展现。本研究各部分的研究结果如下： 1.30d的PFOS胁迫实验和15d的净水恢复实验中，鳃组织中的指标测定结果显示：不同浓度的PFOS胁迫均能显著地降低三角帆蚌鳃组织中的GSH含量，并诱导SOD活性的升高，高浓度（5.0mg/L）组最为明显，说明鳃组织中氧化压迫的存在；而各浓度组鳃组织中MDA含量的升高则说明了细胞内脂质过氧化反应的加剧，证明PFOS胁迫能够对鳃组织造成明显的结构损伤。恢复实验中，仅SOD活性未恢复到对照组水平，但GSH和MDA的含量水平均出现了个体差异增加的现象，预示着三角帆蚌环境适应能力的下降。 2.30d的PFOS胁迫实验和15d的净水恢复实验中，肝胰腺中的指标测定结果显示：低浓度（0.1mg/L）的 PFOS胁迫能够普遍地诱导肝胰腺中 GSH含量以及SOD、GST、ALT和AST活性的升高；中浓度（1.0mg/L）组和高浓度（5.0mg/L）组的上述各指标则均呈现出先诱导后抑制的时间效应，而其由诱导状态向抑制状态的过渡均发生于4d前后，预示着该时段可能是组织损伤集中出现并逐步加剧的毒性关键期。PFOS对肝胰腺中MDA含量的诱导作用明显，表明肝胰腺内脂质过氧化反应的加剧。本章实验还发现肝胰腺中GSH含量的变化与同组的GST活性变化存在较强的联系，高浓度最为明显（P<0.05）。在证明PFOS对肝胰腺细胞解毒机制激活作用的同时，也预示着低浓度（0.1 mg/L）胁迫下，多数的GSH被用于胞内活性氧的去除，而高浓度胁迫下，细胞的排毒作用则消耗了更大比例的GSH。另外，ALT和AST的变化规律显示，PFOS能够对肝胰腺的物质代谢造成显著影响，而其原因则极有可能是氧化压迫和组织损伤。恢复实验阶段，多数指标未恢复到对照组水平，但具有恢复的趋势，可能需要更长的恢复期。 3.本章实验以第二章结论为线索，对PFOS胁迫4d时三角帆蚌鳃组织和肝胰腺中的指标变化进行了测定，并分析了Caspase-3和Caspase-9的活化程度，最后分别对鳃组织和肝胰腺进行了 TUNEL细胞凋亡原位染色分析。结果显示：PFOS胁迫4d时，鳃组织中的GSH含量显著降低，并伴随着GST活性的升高和GPx活性的下降，说明鳃组织中GSH结合有毒物质的能力有所上升，但消除自由基的能力下降。肝胰腺GST和GPx活性的变化与鳃组织类似，但其GSH含量和GR活性出现了显著的诱导，这可能机体中PFOS向肝胰腺的主动运输有关。鳃组织和肝胰腺中的CAT活性和MDA含量均出现了显著的诱导，说明两组织中均存在明显的氧化损伤。高浓度胁迫组的鳃组织中，ACP的浓度显著升高而AKP的浓度则显著下降，说明其中可能存在较严重的细胞溶解现象，并伴随着代谢功能的障碍。细胞凋亡检测方面，中浓度组和高浓度组肝胰腺中的caspase-3和caspase-9均有显著的升高（P<0.05），而鳃组织则仅在高浓度组的caspase-9检测中发现了显著诱导（P<0.05）。TUNEL细胞凋亡原位检测的结果显示，不同浓度PFOS胁迫组的鳃组织和肝胰腺中均有大量的凋亡细胞，与对照组形成明显的对比，印证了组织损伤的存在。 综上所述，PFOS胁迫能够对三角帆蚌鳃组织和肝胰腺造成显著的氧化压迫，造成脂质过氧化反应的加剧，同时诱发细胞凋亡信号蛋白的活化，加剧组织内的细胞凋亡，最终对组织的结构和功能造成明显的影响。

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引言

1 环境中PFOS的来源

2 环境中的PFOS污染

3 生物体内的PFOS污染

4 PFOS的生物毒性

5 本实验的目的和创新点

第二章 PFOS对三角帆蚌鳃组织抗氧化指标的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小结

第三章 PFOS对三角帆蚌肝胰腺的氧化压迫及功能损伤

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小节

第四章 PFOS对三角帆蚌的氧化损伤和凋亡诱导

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 本章小节

第五章 结论与展望

1 实验的缺陷和不足

2 研究方向展望

致谢

参考文献