兴国红鲤ERs、AR基因的克隆表达及EE2、MT暴露对幼鱼肝中ERs、AR基因表达的影响

摘要

环境雌激素/雄激素具有类激素的作用，通过各种途径进入生物体内能够模仿机体内源性激素干扰生物包括人类的内分泌活动。乙炔雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE2）属于环境雌激素，环境中的甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）属于环境雄激素，这两种环境激素进入机体主要是通过雌激素受体（Estrogen Receptors，ERs）和雄激素受体（AndrogenReceptor，AR）来干扰机体内正常的分泌等生理活动。 本研究克隆了兴国红鲤（Cyprinus carpio var singuonensis）雌激素受体ERs四种亚型ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2和雄激素受体AR基因的全长cDNA序列及卵黄蛋白原基因（vitellogenin，vtg）的部分cDNA序列。ERα全长2109 bp，包含189 bp的5’非翻译区（Untranslated Regions，UTR）和237 bp的3’UTR，开放阅读框（Opening reading frame，ORF）为1683 bp，编码560个氨基酸；ERβ全长2147 bp，包含330 bp的5’UTR、编码559个氨基酸的1680 bp ORF和137 bp的3’UTR；ERβ1全长2300 bp，包含364 bp的5’UTR、编码585个氨基酸的1758 bp ORF和178 bp的3’UTR；ERβ2全长2007 bp，包含156 bp的5’UTR、编码544个氨基酸的1635 bp ORF和216 bp3’UTR。AR基因全长3229 bp,包括5’UTR104 bp,3’UTR485 bp及2540 bp的ORF。AR编码区编码846个氨基酸。氨基酸序列多重比对分析表明，兴国红鲤ERs和AR基因编码的氨基酸分别与其它几种鲤科鱼类如鲤（Cyprinus carpio）、彭泽鲫（Carassius auratus var. pengze）、台湾铲颌鱼（Onychostoma barbatulum）、稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）和银鲫（Carassius auratus gibelio）等的ER和AR氨基酸序列具有较高的相似性。 采用 N-J法分别对兴国红鲤及其它脊椎动物的 ERs和 AR进行系统发生分析。结果表明，在高等脊椎动物和硬骨鱼类中 ER聚为两类，鱼类及哺乳动物的ERα聚成一类，而ERβ、ERβ1和ERβ2聚为一类；兴国红鲤的四种ER亚型分别与鲤的四种相应亚型的亲缘关系最近。AR在分子进化上鱼类和高等脊椎动物分别聚为一枝，兴国红鲤的AR与银鲫、金鱼、彭泽鲫聚为一枝，遗传距离最小，和哺乳动物人、大白鼠在两个明显不同的分枝。 采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）对各组织中ERs、AR和vtg的表达情况进行检测，结果表明，四种ERs亚型在雌雄成体组织中呈现差异表达，雌性个体中，肝、卵巢和肠中四种 ERs的表达量均较高；雄性个体中，ERα和ERβ主要在肝中表达，ERβ1、ERβ2分别在肠和精巢中的表达量最高。AR在雌性个体的肝、卵巢、肾、肌肉和端脑中有表达，其中肝中的表达量最高；vtg主要在肝、端脑和鳃中表达。 将150日龄的兴国红鲤雌性幼鱼分别暴露在0.01、0.1和1 nmol/L的17α-乙炔基雌二醇（17α-Ethinylestradiol，EE2）中4周，检测其肝中四种ERs基因的表达变化。结果表明，在EE2中暴露1~2周后，兴国红鲤雌性幼鱼肝中ERα基因的表达水平有极显著的提升；各浓度 EE2能持续显著促进其肝中ERβ的表达；在1~2周内各浓度EE2对 ERβ1表达量有所抑制；第1周EE2能够抑制ERβ2基因mRNA的表达，并在0.01 nmol/L时抑制作用达到了显著的水平。以上结果说明兴国红鲤雌性幼鱼受 EE2暴露后其肝中不同的雌激素受体亚型表达量的变化不同。且ERα可以作为EE2短期（1~2周）的敏感性生物学标志物。同样的，将150日龄的兴国红鲤雌性幼鱼在50μg/L的甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）暴露4周后，采用qRT-PCR检测了肝中AR和vtg的表达情况。在处理第1、2周，AR的表达受到一定的抑制，而在第3、4周其表达量升高，但其表达无显著性变化；而vtg的表达量在第3、4周均有极显著的升高。相对于AR基因，vtg可以作为敏感性生物学标志物。 本研究首次克隆得到了兴国红鲤雌激素受体ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2和雄激素受体AR基因的全长cDNA序列，并通过多重序列比对和系统进化树分析验证了我们所得到的序列的正确性。此外，本实验使用 qRT-PCR技术检测了ERs和 AR基因在兴国红鲤各组织中的表达情况，并对兴国红鲤雌性幼鱼进行了 EE2和 MT暴露实验，检测了其肝中ERs和AR基因的表达情况。结果表明，EE2暴露对不同亚型的ERs mRNA的表达均有影响，且产生的影响不同，而MT暴露对兴国红鲤幼鱼肝AR mRNA的表达量无显著影响，但对vtg的mRNA表达量有一定的影响。

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引言

第一章 文献综述

1雌激素受体ER和雄激素受体AR的研究进展

1.1雌激素受体和雄激素受体的概述

1.2 雌激素受体和雄激素受体的分类

1.3 雌激素受体的结构和功能

1.4 雄激素受体的结构和功能

1.5 雌激素受体和雄激素受体的信号转导通路

1.6 雌激素受体和雄激素受体在硬骨鱼类中的表达模式

2 EDCs的危害

2.1 环境中EE2和MT的危害

2.2 EE2和MT分别与ERs和AR的关系

3 研究的目的和意义

3.1 选择EE2和MT的意义

3.2 选择兴国红鲤作为实验动物的意义

第二章 兴国红鲤雌激素受体ERα、ERβ、ERβ1 和ERβ2和雄激素受体AR基因全长的克隆与表达

1 材料与试剂

1.1 主要仪器

1.2主要试剂

1.3 试验用鱼及其组织样品

2 实验步骤

2.1 提取组织总RNA

2.2 cDNA模板制备

2.3 ERs和AR中间片段的克隆

2.4 ERs基因和AR基因cDNA末端序列的快速扩增

2.5 DNA片段的纯化回收

2.6 连接和转化反应

2.7 阳性克隆的筛选

2.8 测序及生物信息学分析

2.9 实时荧光定量法检测ERs和AR基因的组织表达

3 结果与分析

3.1 总RNA的提取

3.2 兴国红鲤雌激素受体ERs和AR基因cDNA全长的克隆

3.3 兴国红鲤ERs和AR氨基酸序列同源性比对及系统发生分析

3.4 兴国红鲤ERs和AR基因的组织表达结果

4 讨论

4.1 兴国红鲤ERs几种亚型和AR基因的分析

4.2 兴国红鲤ERs和AR基因组织分布与其功能的关系

小结

第三章 EE2和MT对兴国红鲤幼鱼肝中ER及AR基因mRNA 表达的影响

1 材料与方法

1.1 主要仪器

1.2 主要药品和试剂盒

1.3 试验用鱼

2 EE2和MT暴露试验

2.1 实验设计

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

小结

结论

参考文献

附录一

附录二

致谢