牙鲆性腺相关miR-200b及dazl、wt1a基因的鉴定与表达

摘要

牙鲆(Paralichthys olivaceus)中已有不少关于性腺发育和分化相关基因的鉴定和功能分析报道，但此类基因的挖掘多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析，对其转录后水平调控尤其是 microRNA（miRNA）的研究鲜有报道。本实验室先前已建立了牙鲆精卵巢miRNA文库，并通过第二代测序(NGS)技术和生物信息学方法鉴定了141个成熟miRNA，筛选出一批在牙鲆雌雄性腺中差异或特异表达的miRNA。在此基础上，本研究挑选了1个表达量较高且在精卵巢中显著差异表达的 miRNA-200b，进一步采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法和原位杂交技术分析了pol-miR-200b在牙鲆性腺中的表达，并克隆和鉴定了其中和生殖相关的dazl和wt1a基因，并利用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法分析了温度、外源性激素对pol-miR-200b、dazl和 wt1a基因表达的影响。该研究对进一步阐述miRNA-靶基因在牙鲆性腺分化和发育中的作用提供了理论基础。 首先，提取牙鲆成鱼精卵巢总 RNA,并采用 RT-qPCR法检测了miRNA-200b在牙鲆精卵巢中的表达情况，结果表明：pol-miR-200b在牙鲆精、卵巢中存在差异表达，且在卵巢中的表达量显著高于精巢。牙鲆成鱼精、卵巢经4%多聚甲醛固定后制备石蜡切片，然后进行原位杂交检测，其定位结果显示：pol-miR-200b蓝紫色阳性信号明显成片状分布且多集中在卵母细胞及其细胞边缘的滤泡膜上，在成熟的精子细胞中阳性信号成稀少的片状分布，主要分布在小叶腔内。这些结果表明pol-miR-200b可能在牙鲆性腺的发育中发挥重要作用。 DAZL（Deleted in AZoospermia-like）基因是多种物种精子发生的重要调控因子，为探讨该基因在牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺发育分化中的作用，本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列，利用生物信息学方法分析了其序列结构，并利用实时荧光定量 PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现：牙鲆dazlcDNA序列全长2031 bp，包括105 bp的5'端非翻译区，1275 bp的3'端非翻译区和编码217个氨基酸残基的651 bp开放阅读框；氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的RRM（RNA recognition motif）结构域，且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性；荧光定量PCR结果显示dazl基因主要在牙鲆性腺中表达，且在精巢中的表达高于卵巢；在牙鲆早期发育阶段，dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有较高的转录本，而在原肠胚期表达开始降低，至孵化后3天一直保持较低的水平，这些丰富表达的母源性dazl mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。 WT1基因起源于的成人各种肿瘤，包括胰腺癌、肺癌、结肠癌、脑肿瘤、硬纤维瘤和乳腺癌，该基因还与精巢的发育相关。本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆Wt1a基因的cDNA序列，利用生物信息学方法分析了其序列结构，并利用实时荧光定量 PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现：牙鲆wt1a cDNA序列全长2051bp，其中包含416bp的5'端非翻译区，390 bp的3'-UTR和编码415个氨基酸残基的1245 bp开放阅读框；氨基酸同源序列比对显示该序列存在4个高度保守的锌指结构，且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性；荧光定量PCR结果显示Wt1a基因主要在牙鲆性腺中表达，且在精巢中的表达高于卵巢，表明Wt1a参与雄性性别发育和成熟；在牙鲆早期发育阶段，Wt1a基因在未受精卵、受精卵以及受精后囊胚期表达量很低，神经胚突然升高随后缓慢降低直至孵化时期，但是孵化后慢慢升高在孵化后14d达到最高随后降低并保持平稳的表达水平。这些丰富表达的 wt1a mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。 为探讨高温和外源性激素对牙鲆性腺相关 miR-200b、dazl和Wt1a的表达，本研究设置高温（28℃）处理组、17β-雌二醇（17β-E2）处理组、17α-甲基睾甾酮（17α-MT）处理组以及空白对照组，利用RT-qPCR法分析了miR-200b、dazl和Wt1a在牙鲆性腺分化过程中的表达情况。结果发现 pol-miR-200b在45d、55d和85d幼鱼中，miR-200b的表达量逐渐升高，且雌激素组高于其他组；65d时卵巢开始分化，此时高温组miR-200b表达水平高于其他组；但在105d时，其表达量没有继续升高。牙鲆 dazl基因在整个性腺分化过程中大致保持不断上升的表达水平，且高温组的表达水平最高；65d时，高温处理组和雄激素处理组的表达水平略有降低，而雌激素处理的表达水平较高；Wt1a基因的表达水平在35d、45d、55d和65d牙鲆各处理组表达水平很低，升高趋势很慢，而在85d和105d，其表达迅速升高。孵化后55d和65d是牙鲆精卵巢开始分化的时间，而85d和105d则是牙鲆精卵巢早期发育的时期，上述结果表明wt1a基因可能参与了精巢和卵巢的早期形成。

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引言

1 鱼类性别决定

2 dazl基因概述

3 WT1基因概述

4 microRNA简介

5 研究的目的和意义

第一章 pol-miR-200b在牙鲆性腺中的表达分析

1 实验材料

2实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 牙鲆dazl、Wt1a基因的克隆与表达分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4讨论

第三章 温度、性激素对牙鲆性腺分化过程中miR-200b、

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

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