半滑舌鳎食欲素的克隆与体外重组表达研究

摘要

本文以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象，采用解剖学、组织切片、电镜观察和两种染色技术研究了半滑舌鳎消化道的组织结构特征。在认识消化系统组织学结构基础上，运用RACE方法获得了半滑舌鳎食欲素(orexin)的全长cDNA序列并对其进行特征性分析，采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测了orexin mRNA在不同胚胎、仔稚幼鱼发育阶段和成鱼不同组织中的时空表达水平；最后利用原核表达技术实现了半滑舌鳎orexin A和orexin B成熟肽体外重组表达和生物活性检测，获得了具有生物活性的重组蛋白。本研究结果为揭示半滑舌鳎的摄食调控机制和开发健康养殖技术提供了基础资料和理论支撑。主要研究结果如下： 1.半滑舌鳎消化道显微与超微结构研究 采用解剖学、组织切片、电镜观察和两种染色技术研究了半滑舌鳎消化道的组织结构特征，观察了各部分消化道的显微和超微结构，测定了消化道各部分的黏膜褶皱数、黏膜褶皱高度、肌肉层（纵肌和环肌）厚度、黏液细胞相对密度等数量指标。结果显示：消化道可分为口咽腔、食道、食道胃、前肠、后肠等五部分。半滑舌鳎不具备结构特征明显的胃，摄食后食道后部与肠道连接部形成一个囊状膨大结构，称之为食道胃；食道前部开始出现杯状黏液细胞，整个食道以Ⅲ型黏液细胞为主，食道胃中黏液细胞以Ⅲ型为主，前肠黏液细胞以Ⅳ型为主，后肠黏液细胞以Ⅱ型为主。研究结果为认识半滑舌鳎消化与吸收生理机制及研制人工养殖用饲料提供参考资料。 2.半滑舌鳎orexin的基因克隆、组织分布和早期生长发育表达特性 采用RACE方法，首次从半滑舌鳎下丘脑中克隆到orexin cDNA全长序列。cDNA序列全长为734 bp，包括87 bp的5’非编码区（UTR）、417 bp的开放阅读框（ORF）和230 bp的3’非编码区（UTR），编码139个氨基酸的前体蛋白。其中包括36个氨基酸的信号肽，43个氨基酸的orexin A成熟肽、28个氨基酸的orexin B成熟肽、26个C端未知功能的肽段和两个GKR蛋白水解位点。系统进化分析表明，半滑舌鳎orexin其它鲽形目鱼类处于同一分支。 定量PCR分析结果显示，半滑舌鳎orexin mRNA主要在脑中表达，此外在鳃、食道胃和脾脏中有较高表达，在其它组织中有微量表达，表明其具有广泛的表达特性。orexin mRNA在胚胎发育初期阶段未检测到表达，最早在囊胚期检测到表达，其后随胚胎发育进程呈总体升高趋势，并在胚胎即将孵化出膜期达到峰值。半滑舌鳎orexin mRNA表达水平在1-180日龄内随苗种生长发育而逐渐升高。上述结果表明orexin可能在半滑舌鳎胚胎发育和早期生长过程中中发挥重要调控作用。 3.半滑舌鳎orexin A和orexin B成熟肽的重组表达及活性分析 根据克隆得到的半滑舌鳎 orexin全长序列，设计带酶切位点引物克隆得到orexin A和orexin B成熟肽序列。利用PCR方法将扩增片段连接到原核表达载体pET-32a上，得到的重组质粒导入到大肠杆菌 BL21后经 IPTG诱导产生 N端含His标签的融合蛋白。预测orexin A重组蛋白大小为24.90 kDa，orexin B重组蛋白大小为21.14kDa。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分别确定orexin A和orexin B重组蛋白诱导的最佳温度分别为32℃和37℃、诱导剂浓度和表达时间均为1 mmol/L和6 h，得到的orexin A和orexin B重组蛋白最大表达量分别占细菌总蛋白的52.8%和43.5%，并主要分泌在上清液中。Western blotting免疫印迹表明获得的重组蛋白可被63His抗体特异性识别。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎 orexin重组蛋白。下丘脑离体孵育实验表明，获得的 orexin重组蛋白能显著影响半滑舌鳎下丘脑NPY mRNA、orexin mRNA和NPY肽水平的表达和分泌，表明获得的重组蛋白具有生物活性。研究结果可为深入探究 orexin在半滑舌鳎生长发育中的作用机制及研制高效绿色的促摄食制剂提供基础资料。

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引言

第一章 文献综述

1鱼类orexin的研究进展

1.1 orexin基因结构特点

1.2 orexin及其mRNA的分布

1.3 orexin的受体及其分布

1.4 orexin的生理功能

2 orexin的应用

第二章半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）消化道显微与超微结构研究

1 材料和方法

1.1 实验鱼来源

1.2 组织学观察

1.3 电镜观察

1.4 数据统计分析

2 结果

2.1 消化道形态特征

2.2 消化道组织学特征

2.3 食道胃和肠道超微结构

2.4 消化道黏液细胞数量分布特点

3 讨论

第三章 半滑舌鳎orexin基因的克隆、组织分布和早期生长发育表达特性

1 材料与方法

1.1 实验用鱼及样品处理

1.2 总RNA提取

1.3 cDNA第一链合成

1.4 5’端和3’端cDNA序列克隆

1.5 序列分析

1.6qPCR检测orexin mRNA的相对表达量

1.7 数据统计分析

2 结果

2.1 半滑舌鳎orexin cDNA全长序列

2.2 半滑舌鳎orexin氨基酸序列相似性分析

2.3 半滑舌鳎orexin系统进化分析

2.4 半滑舌鳎orexin mRNA组织表达特性分析

2.5 半滑舌鳎orexin mRNA胚胎发育中表达特性分析

2.6 1-180日龄半滑舌鳎orexin mRNA表达特性分析

3 讨论

3.1 半滑舌鳎orexin的基因序列特征及同源性分析

3.2 半滑舌鳎orexin的基因在不同组织和早期生长发育表达特性

第四章半滑舌鳎orexin A和orexin B体外重组表达及活性分析

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

1.2 orexin A成熟肽的克隆

1.3 重组质粒的构建

1.4 重组质粒在表达菌株中的表达

1.5 重组蛋白的Western-blotting验证

1.6 重组蛋白的纯化和复性

1.7orexin A重组蛋白生物活性检测

1.8数据分析

2 结果

2.1 表达载体构建

2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达

2.3重组蛋白的western-blotting 验证

2.4 重组蛋白的纯化

2.5 重组蛋白的生物活性检测

3 讨论

3.1 orexin成熟肽体外重组表达

3.2 重组蛋白活性检测

结论

参考文献

致谢