在两种转化的莱茵衣藻中pepc2基因表达的正反向调控

摘要

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）在高等植物中可以固定CO2，但是对真核藻PEPC的功能研究较少，尤其是“细菌型”磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC2）。为了探究PEPC2功能，并构建高产油工程藻，本文尝试用抑制莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)PEPC表达的方法来提高莱茵衣藻的脂质含量。莱茵衣藻PEPC有五段保守序列（CS），两个活性位点（H和K），本文克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPC的CSⅠ序列起始的
　　639bp，该片段还包含了一个活性位点（H），构建了pSP124s-HR-reve-Crpepc2和pSP124s-HR-forw-Crpepc2两种莱茵衣藻细胞核表达载体和pASapl-forw-Crpepc2和pASapI-reve-Crpepc2两种莱茵衣藻叶绿体表达载体，通过莱茵衣藻细胞核转化和叶绿体转化来探究莱茵衣藻“细菌型”PEPC对其代谢产物的影响。
　　第一章探究了用细胞核转化调控莱茵衣藻“细菌型”PEPC表达后，对莱茵衣藻及其突变株的各项生理生化指标的影响。结果表明，反向突变株的Crpepc2基因被下调，有高光合效率和较低的暗呼吸，这可能与降低的光饱和点和提高的光补偿点有关。相反，正向型突变株的Crpepc2基因被上调，具有较高的暗呼吸效率和较低的光合效率，这可能是因为光补偿点降低，光饱和点提高了。在这项研究中我们发现PEPC的活性与蛋白质和油脂的积累也有关系，正向突变株有较高的PEPCase活性，促进了蛋白质的积累；反向突变株PEPCase活性被抑制促进了油脂的生物合成。对Crpepc2基因的抑制还增强了反向型突变株对低温和pH的耐受性。不仅如此，反向型突变株的不饱和脂肪酸含量增加，这可能与其抗性增强有关
　　根据以上数据，我们提出下述假设：莱茵衣藻的PEPC可能是一种平衡C和N代谢的连接酶。PEPCase活性的下调提高了光合作用，并促进PEP流向脂质合成。此外，PEPCase的上调提高了呼吸作用，并促进蛋白质的合成。因此PEPC不仅能影响莱茵衣藻的光合作用和碳代谢，还能影响N化合物和能量的代谢。
　　第2章和第3章将克隆的639bp片段通过叶绿体转化的方法克隆进入莱茵衣藻cc-400品系中，并检测了cc-400野生型及其突变株的生理生化指标的变化情况。叶绿体转化我们做得比细胞核晚，但其具有高转化与表达效率，且在定向转化叶绿体的问题已经解决，所以用莱茵衣藻的叶绿体转化方法将更有助于提高其代谢产物的产量。首先本实验通过荧光定量PCR方法检测了Crpepc2的相对表达量，至今还未见到有关Crpepc2基因叶绿体表达的报道。其次，观察到PEPC可以调控光合产物的分配，所以过表达的PEPC促进蛋白质的合成，并抑制PEPC的表达促进脂质的积累。有意思的是调控PEPC表达，对突变株的生长影响不大。综上所述，莱茵衣藻叶绿体转化方法产生的突变株其各项生理生化指标跟细胞核转化方法产生的突变株表现出相似的现象，莱茵衣藻“细菌型”PEPC可以调控蛋白质和脂质的积累，且不影响藻的生长，蛋白质含量的提高有助于今后外源性蛋白的表达，脂质含量的提高有助于构建高产油工程藻。
　　与细胞核转化可发现叶绿体转化有以下特点：反向叶绿体转化株的油脂含量增加了70.32％，反向细胞核转化株的油脂含量增加了39.24%，是核转化的数据的1.79倍；同时脂肪酸含量也较高，尤其是不饱和脂肪酸含量。在光合参数方面：反向细胞核突变株的光饱和点增加了19.06%，反向叶绿体突变株增加了29.49%；反向细胞核突变株的光补偿点下降了26.09%，反向叶绿体突变株降低了51.31%。呼吸作用方面：正向细胞核突变株增加了19.77%，正向叶绿体突变株提高了32.44%；反向细胞核突变株下降了21.22%，反向叶绿体突变株降低了28.21%。蛋白质含量的变化：正向细胞核突变株蛋白质含量增加了26.99%，正向叶绿体突变株增加了37.03%。通过上述分析发现，不管是细胞核突变株还是叶绿体突变株生理生化指标均表现出相似的趋势，但是叶绿体转化方法表现出的趋势更加明显，油脂和蛋白质含量均提高较多，两种转化均说明PEPC2会影响莱茵衣藻的光合作用，叶绿体转化的数据也支持我们的假设。
　　化石燃料作为不可再生能源，将在数十年内耗尽，生物能源尤其是微藻生物柴油具有清洁、来源广泛及用途广等优点，成为最有希望的石油替代能源之一。通过筛选含油量高的藻株或从生理生化水平提高细胞含油量，难以在生长和含油率中找到平衡点，难以在生产中应用，且难以真正降低生产成本，近40年来已做了许多努力，但难以产业化。因此，大家越来越寄希望于用基因工程手段提高产油率。本文构建的反向突变株有可能为产油工程藻做贡献。

目录

声明

引言

1. 微藻代谢

2. 叶绿体植物反应器

3. 莱茵衣藻研究

4. 莱茵衣藻的DNA转化

5. 莱茵衣藻DNA转化方法

6. 生物柴油研究

7. 本研究的目的及意义

第一章 莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因细胞核表达及其代谢调控

1.材料方法

2.结果

3.讨论：

4.结论

5.展望

第二章 莱茵衣藻“细菌型”pepc2 基因叶绿体表达载体的构建与筛选

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

5.展望

第三章．莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因的叶绿体表达及对蛋白质，脂质代谢调控

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

5.展望

讨论

参考文献

致谢

附录：科研活动与成果