鲂鲌杂交群体的染色体核型分析、草鱼重复基因fgf1克隆及鲫鱼HOX基因初步研究

摘要

团头鲂(M.amblycephala)和翘嘴鲌(Erythroculter ilishaeformis)属硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，二者分属鲌亚科的鲂属和鲌属，在我国的经济养殖中占据重要的地位。通过杂交育种可获得具有双亲优良性状的杂交新品种。杂交后代往往表现出较大的性状差异，对其进行染色体核型分析有助于研究杂交后代遗传组成与性状的关系。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是一种重要的淡水养殖鱼类，生长快，个体大，是生长相关研究的良好实验材料。鲫鱼广泛分布于全国各地，具有较强的适应性，另外其多样性高且基因组加倍，是研究进化和发育遗传学的良好材料，而 Hox基因家族由古老的祖先基因进化而来，在进化的过程中高度保守，其平行进化同源基因的结构和数量并不是一成不变的，而是随着基因组的复制而不断变化，这些使得它们成为研究生物进化及基因组复制的重要模型。本研究包括以下三方面：
　　(一)采用植物血球凝集素(PHA)和秋水仙素体内注射方法，制备了团头鲂、翘嘴鲌、鲂鲌回交子代(TTF(♀)×FB(♂)、FB(♀)×TTF(♂)、QZB(♀)×FB(♂)、FB(♀)×QZB(♂))及其亲本鲂鲌、鲂鲌自交子代共8种鱼的染色体。结果表明：各群体染色体组均由48条染色体组成，其中，团头鲂的核型为：2n=18m+26sm+4st，NF=92；翘嘴鲌的核型为：2n=16m+26sm+6st，NF=90；鲂鲌的核型为：2n=14m＋28sm＋6st，NF=90；TTF(♀)×FB(♂)的核型为：2n=16m+28sm+4st，NF=92；FB(♀)×TTF(♂)的核型为：2n=16m+30sm+2st，NF=94； QZB(♀)× FB(♂)的核型为：2n=12m+32sm+4st，NF=92；FB(♀)×QZB(♂)的核型为：2n=16m+30sm+2st，NF=94；鲂鲌自交子代的核型为：2n=14m+28sm+6st，NF=90。显然，各杂种后代染色体核型与预期的结果出现了偏差，并不是由亲本各提供一半染色体简单组合而成，而是表现出了多态性。另外，本研究还运用流式细胞法对各群体的DNA含量进行了测定，探讨了各群体的遗传组成情况，为鱼类杂交育种研究提供了依据。
　　(二)成纤维细胞生长因子1(Fgf1)是一种促有丝分裂因子，对脊椎动物细胞的增殖、生长和分化起到非常重要的调节作用。本文中，我们介绍了两个重复基因fgf1在草鱼中的分离及功能表达。草鱼fgf1a和fgf1b两个基因cDNA差异较大，二者所编码的氨基酸序列相似度仅为50％。fgf1a mRNA和fgf1b mRNA二者都是在受精卵时期就开始表达，并且在胚胎发育的各个时期均有表达。在胚胎发育后的12小时，fgf1a和fgf1b主要在脊索中表达；胚胎发育后的24小时，fgf1a mRNA主要在内胚层和肌节表达，而fgf1b mRNA主要在脊索和尾巴表达；在胚胎发育的36小时，fgf1a和fgf1b两个基因mRNA都在脑、肌节和尾巴有表达，除此之外，fgf1a在卵黄囊的基部、fgf1b在胸鳍处也有表达。在成年鱼各组织中，重复基因fgf1a和fgf1b mRNA也有不同程度的表达。对草鱼进行2到6天饥饿处理后，我们对草鱼脑、肝脏、肌肉三个组织中fgf1a和fgf1b两个基因的表达情况做了检测，发现fgf1a和fgf1b的mRNA水平在肌肉和肝脏中都是上升的，而在脑中的表达，fgf1a mRNA水平是上升的，fgf1b mRNA则是显著下降的。此外，对草鱼注射10μg或50μg重组人类生长激素(hGH)后，发现 fgf1a和 fgf1b两个基因在脑和肌肉中的mRNA水平都是显著下降的；而在肝脏中却没有显著的变化。结果表明：重复基因fgf1s可能在草鱼的生长和发育过程中起着重要的，但二者的作用又不完全相同。
　　(三)本研究中，我们共筛选出59个鲫鱼Hox基因的部分氨基酸片段，其中包括重复基因，片段大小不等，在85~868个AA之间。所有的Hox基因序列分别属于7个不同的基因簇(HoxAa，HoxAb，HoxBa，HoxBb，HoxCa，HoxCb，HoxDa)，其中有6个HoxAa基因，10个HoxAb基因，10个HoxBa基因，8个HoxBb基因，14个HoxCa基因，3个HoxCb基因，8个HoxDa基因。每个基因的氨基酸序列中都有一个约60个氨基酸组成的保守结构域。在筛选出的鲫鱼Hox基因中，有75％的基因都存在两个拷贝，他们为两个不同的Hox重复基因，属于旁系同源物，这些重复基因所编码的氨基酸的序列相似性在44％~99％之间。根据 Hox基因的组成，我们推测鲫鱼在进化的过程中其基因组发生了第四次复制。系统发育树结果显示：不同物种的直系同源基因聚为一个大支。聚类类型大致分四种：一是 Hox基因最先与鲤鱼聚为一支，用红色实线标注，占41％；二是Hox基因最先与斑马鱼聚为一支，用蓝色实线标注，占34％；三是鲤鱼和斑马鱼先聚为一支，然后再与鲫鱼聚为一支，用黑色实线标注，占12％；还有一种是鲫鱼先与大西洋鲑或虹鳟聚为一支，用黄色实线标注，占13％。据此，我们可以看出鲫鱼与其他鲤科鱼类聚类良好，并能够初步断定其亲缘关系。G-C含量分析显示：两个重复基因序列的G-C含量相差不大，但也有例外，如A9bⅰ/A9bⅱ，B1aⅰ/B1aⅱ，B2aⅰ/B2aⅱ，B1bⅰ/B1bⅱ，B13aⅰ/B13aⅱ，C1aⅰ/C1aⅱ。一方面我们认为：所筛选到的某些Hox基因序列并不是全部的CDS序列，这造成了重复基因G-C含量的差异；另一方面我们认为：重复基因氨基酸序列的相似性也是影响G-C含量差异的因素，当两个重复基因氨基酸序列相似度低时，其G-C含量差异也较大。这些实验结果为以后有关鲫鱼的进化与起源以及推测鲫鱼第四次基因组复制发生时间的研究奠定了坚实的基础。

目录

声明

引言

一、鲂鲌(团头鲂(♀)×翘嘴鲌(♂))杂交群体染色体核型的研究进展

二、成纤维细胞生长因子1(fgf1)的作用机制及研究进展

三、鱼类基因组复制及鲫鱼Hox基因的研究进展

四、本研究的目的和意义

第一章 鲂鲌杂交群体的染色体核型分析

1.1材料与方法

1.2 结果及分析

1.3 讨论

第二章 草鱼成纤维细胞生长因子1(fgf1)的表达与调控

2.1 材料和方法

2.2 实验结果与分析

2.3 讨论

第三章 鲫鱼HOX基因初步研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

结论与展望

(一)结论

(二)展望

参考文献

附录：英文缩略语表

致谢

硕士期间发表的论文