七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)性腺转录组分析及vasa基因的时空表达

摘要

七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi）为原生于南美洲亚马逊河流域的热带观赏鱼，素有“热带鱼之王”的美称。尽管至今七彩神仙鱼的养殖技术早已普及，但因为其早期性别区分困难，不易从外型上进行雌雄辨别，该鱼的繁殖依旧是通过自然配对、自然产卵的方式进行的。这种人工模拟的繁殖方式，需要较久时间的配对，拉长了繁殖周期；再者，该鱼产卵量少，且其人工催产技术也尚未能突破，这些因素都极大地制约苗种的生产，限制了七彩神仙鱼的规模化养殖。因此，为了促进七彩神仙鱼的人工繁殖和产业化发展，对七彩神仙鱼的性腺分化时间、发育规律进行深入研究非常有必要。掌握七彩神仙鱼卵巢和精巢的相关生物信息将有助于我们研究雌雄辨别方法、加快人工催产的进程，从而进一步的控制七彩神仙鱼繁殖的速度和质量。
　　本研究运用下一代高通量测序技术对七彩神仙鱼性成熟时期的精巢和卵巢组织进行转录组测序，经过对高质量序列重头组装、拼接和功能基因注释，发掘了与性别决定、生殖细胞发育等重要生命进程相关的候选基因，为后续功能基因的研究、筛选细胞分子标记及早期性别分化提供重要参考；利用RACE技术从转录组数据中验证并克隆七彩神仙鱼vasa的cDNA全长，用Q-PCR技术对vasa基因在七彩神仙鱼胚胎各个时期和早期发育阶段进行了表达分析；根据获得的vasa基因的cDNA序列设计荧光探针，以此标记PGCs，对七彩神仙鱼仔鱼阶段的石蜡切片进行原位杂交，定位PGCs并观察其分化过程，确定其分化时间。主要结果和结论如下：
　　1.七彩神仙鱼性腺转录组分析
　　采用Illumina Hiseq测序平台4000完成七彩神仙鱼成熟期精巢和卵巢组织1个混合样的转录组测序。经过对46,438,930条高质量序列从头组装得到115,050个转录本和97,074个非冗余基因。将拼接得到的序列与Pfam、Swissprot和String等公共蛋白质数据库比对,Nr库中比对到序列最多的物种是尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）；GO数据库注释了大量的功能基因并进行了分类，提供了与性别决定、性腺分化、性激素调控等过程相关的候选基因，如vasa、sox9和foxl2；KEGG注释结果提供了丰富的通路信息，如卵母细胞减数分裂通路。另外，从七彩神仙鱼性腺转录组数据中识别出26,083个SSR和10,571个SNP候选标记，为分子标记的开发提供了重要信息资源。
　　2.七彩神仙鱼vasa基因cDNA的克隆
　　vasa基因是PGCs的第一个分子标记，同时也是生殖细胞的特异性分子标记。本研究利用RACE技术得到七彩神仙鱼vasa基因cDNA序列，全长2,370bp，ORF编码655个氨基酸，长1,968bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的vasa cDNA与尼罗罗非鱼的同源性最高。半定量分析表明，vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达，在其他组织中无表达信号。Q-PCR结果显示，vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及50日龄内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段，vasa mRNA表达持续增加，在囊胚期至孵化期阶段，表达持续降低。在仔鱼阶段，vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现，繁殖前的精巢组织中vasa表达量比繁殖后的表达量低，而卵巢恰好相反。这些研究结果将为研究七彩神仙鱼的原始生殖细胞定位、生殖细胞分子标记及其性腺分化提供参考。
　　3.七彩神仙鱼早期性别分化
　　本研究根据1-70日龄石蜡切片HE染色、荧光原位杂交结果和实验室前期工作确定了七彩神仙鱼性别分化时间。结果表明，七彩神仙鱼雌鱼分化时间约为30-40日龄；雄鱼的分化时间约为50-70日龄；雌性比雄性分化早。另外，七彩神仙鱼为雌雄异体分化类型，不存在雌雄同体或性逆转现象。确定其性别分化时间不仅能帮助研究鱼类性别分化和调控机制，还可以为人工性别控制、单性育种提供参考，为人工催产和提高养殖效率给予理论支持。

目录

声明

第一章 引 言

1.1七彩神仙鱼概况

1.2 转录组的发展

1.3 鱼类原始生殖细胞

1.4 vasa基因研究进展

1.5本研究的目的与意义

1.6 本研究的技术路线

第二章 七彩神仙鱼性腺转录组分析

2.1. 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 七彩神仙鱼vasa基因的时空表达

3.1 实验材料

3.2. 实验方法

3.3 实验结果

3.4讨论

3.5小结

第四章 七彩神仙鱼性别分化时间的确定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

论文总结与展望

1.结论

2.创新点

3. 展望

参考文献

硕士在读期间发表的文章

附录

致谢