碳氮比对高氨氮耐受菌降氮的效果及其作用机制

摘要

为了分离得到高效降解无机氮化合物的高氨氮耐受菌，并研究环境因子对高氨氮耐受菌降氮特性的影响，以及碳氮比对高氨氮耐受菌降氮影响的分子机制。本论文模拟配制氨氮浓度梯度分别为65 mg·L-1、261.7 mg·L-1、523.4 mg·L-1、1046.8 mg·L-1的养殖污水，对从湖南省华容县田家湖渔场富营养化的养殖池底泥分离得到的7株菌株Dy、Td、Fu、NBQ、FM、Hf和Hj进行氨氮耐受试验，以筛选高氨氮耐受菌。比较OD600值和对无机氮化合物的去除率的比较，本论文从7株菌中筛出3株高氨氮耐受菌Dy、Hf和Hj。经16S rDNA鉴定，确定3株菌分别为地衣芽孢杆菌Dy（Bacillus licheniformisficans Dy）、脱氮副球菌Hf（Paracoccus denitrificans Hf）、解淀粉芽孢杆菌Hj（Bacillus amyloliquefaciens Hj）。
　　本论文研究了碳源种类（葡萄糖、蔗糖、乙醇和碳酸氢钠）、碳氮比（1、4、8、12、16和20）、pH（4、5、6、7、8、9、10和11）、温度（15℃、20℃、25℃、30℃和35℃）和转速（20 r·min-1、60 r·min-1、100 r·min-1、120 r·min-1）等环境因子对Dy、Hf和Hj降解氨氮、亚硝态氮和硝态氮的影响。结果表明，3株菌对碳源的利用能力顺序均为：葡萄糖、蔗糖、乙醇和碳酸氢钠。添加葡萄糖作为污水碳源时，3株菌的菌体生长量最大，OD600值达到峰值，降氮效果最佳均达100％；乙醇和蔗糖次之；对照组（无碳源）无机氮化合物的去除率几乎为零。添加葡萄糖为额外碳源，碳氮比为8时，硝态氮被Dy和Hj全部去除；当碳氮比为16时，3株菌对氨氮和亚硝态氮降解率均达100%，OD600值达到峰值。分别向还原性有机碳源充足的261.7 mg·L-1氨氮污水、120 mg·L-1亚硝态氮污水和120 mg·L-1硝态氮污水添加Dy、Hf和Hj菌液，当培养摇床转速为20 r·min-1时，培养基溶解氧浓度低，3株菌繁殖代谢缓慢；当转速为20~100 r·min-1时，3株菌的菌体生长量和氮素降解率随着摇床转速的增加而增加；当转速为100 r·min-1时，无机氮化合物均可被3株菌完全去除，并且OD6oo均达到峰值；但转速为100~140 r·min-1时，3株菌对无机氮化合物的去除率随着摇床转速的增加而降低，与此相对应的OD6oo下降。当培养温度为15~25℃时，本论文分离得到的3株菌的菌体生长和氮代谢能力随着温度的升高逐渐增加；当温度为25℃时，氨氮、亚硝态氮和硝态氮均可被3株菌完全降解，菌株的OD6oo达到峰值；当温度为25~35℃时，3株菌的菌体生长量和氨氮去除速率随着温度的升高而降低。当培养液用0.1 mol·L-1的HCl和NaOH将pH调至5至10时，3株菌对氨氮去除率均高于73%；当pH为4或pH为11时，3株菌对无机氮化合物的降解率显著下降，同时，3株菌的OD6oo值表现出相同的规律。当pH为6至9时，Dy和Hj菌对亚硝态氮和硝态氮有较高的降解率，均高于76%。Hf菌有效降解硝态氮的pH范围比较窄，在7至8之间。3株菌降解不同无机氮化合物时对PH适应范围不同，但pH为7至8时，3株菌均有较强的无机氮化合物降解能力。而且，当pH=7时，3株菌对氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除率均达到100%。
　　挑选对环境因子耐受水平相对较广的Hj菌，分别添加至碳氮比为4和16的氨氮污水中，并对其进行转录分析。不同碳氮比处理Hj后，菌株的转录组测序获得的差异基因，通过GOseq分析表明，有1931个显著表达的差异基因富集在321个GO Subterms中这些显著差异基因主要分布在分子功能、生物过程和细胞组成3个GO terms。例如生物过程、细胞过程、代谢过程、生物氮合成、细胞成分、细胞部分、膜、细胞周边、细胞内、胞外区、细胞器、分子功能、催化活性、结合、水解酶活性等等。将获得的Hj基因富集至KEGG数据库，有523个差异基因分布在93个代谢通路中。例如代谢途径、双组分系统、ABC转运蛋白、碳代谢、氮代谢等等。
　　由此可见，不同的环境因子对高氨氮耐受菌Hf、Dy和Hj的降氮影响差异大，其中碳源种类和碳氮比的影响作用较温度、转速和pH值更明显，但3株菌的最佳生长和氮代谢环境是以葡萄糖为额外碳源，水体碳氮比达到16的25℃、溶氧充足的中性水体。相对Hf和Dy菌， Hj菌对不同环境因子的耐受水平较广泛。通过转录分析不同碳氮比处理后的高氨氮诱导菌Hj，对Hj降氮的分子机制有了初步的研究。

目录

声明

引言

1 水产养殖中无机氮

1.1 水产养殖中无机氮的来源

1.2 水体中无机氮对水产养殖的影响

2 水产养殖污水的脱氮技术

2.1 水产养殖污水的脱氮方法

2.2 生物脱氮原理

3 影响生物降氮的环境因子

3.1 碳源种类

3.2 碳氮比

3.3 溶解氧

3.4 温度

3.5 pH

4 细菌转录组学研究

5 本研究目的、意义及主要内容

5.1 研究目的和意义

5.2 研究内容

第一章 高氨氮耐受菌的筛选和鉴定

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.3 分析方法

2 结果与分析

2.1 高氨氮耐受菌的筛选

2.2 高氨氮耐受菌16S rDNA 鉴定

3 讨论

第二章 环境因子对高浓度氨氮耐受菌降氮特性的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.3 分析方法

2 结果与分析

2.1 碳源对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

2.2 碳氮比对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

2.3 转速对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

2.4 pH对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

2.5 温度对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

3 讨论

3.1 碳源对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

3.2 碳氮比对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

3.3 转速对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

3.4 pH对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

3.5 温度对高氨氮耐受菌降氮特性的影响

第三章 碳氮比对高氨氮耐受菌Hj降氮的转录比较分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 测序质量评估及控

2.2 参考基因比较分析

2.3 Hj 基因数据库功能注释

2.4 差异表达基因筛选

2.5 差异表达基因的GO富集分析

2.6 差异表达基因的KEGG富集分析

3 讨论

3.1 Hj的双组分系统和ABC转运蛋白差异基因

3.2 Hj的碳代谢差异基因

3.3 Hj的氮代谢差异基因

结论

参考文献

致谢