雄性斑马鱼的饲养水吸引雌性并引起雌性斑马鱼产卵行为的研究

摘要

繁殖是生物种族得以延续的重要生命活动。不同生物在长期的进化中形成了多种多样的繁殖机制。在动物中，精子卵子通过结合形成受精卵，由受精卵发育成下一代是一种非常普遍的繁殖方式。在繁殖过程中，雌性和雄性的生殖行为，如雌雄的相互吸引及追逐，雌性卵子的释放及雄性精子的释放等，这些行为需要雌雄个体间建立良好的信息沟通和配合。已有的研究表明性信息素在这一过程中发挥了重要的作用。
　　本研究为分离和鉴定影响斑马鱼生殖的重要性信息素，进行了行为学，并利用色谱质谱联用（GC-MS）技术和高效液相色谱（HPLC）技术对雄性斑马鱼的饲养水化学组分进行了嗅觉电生理（EOG）的综合研究。
　　第一部分，我们通过影响斑马鱼生殖行为的两个重要因素—视觉和嗅觉（信息素）—的刺激，进行了行为学验证与分析；证明雄性斑马鱼的饲养水可以吸引雌性斑马鱼并且可以引起雌性斑马鱼产卵。
　　在雄性斑马鱼的饲养水能够显著地吸引雌性斑马鱼的实验中，我们用性成熟的雄斑马鱼视觉接触与否和雄性斑马鱼饲养水接触与否两种不同组合方式对性成熟的雌性斑马鱼进行刺激。用不可视不接触饲养水的状态下，雄性对雌性的性吸引百分比作为空白对照，通过对比仅有视觉接触、仅有雄性饲养水接触两种不第三部分中，我们对雄性斑马鱼和雌性斑马鱼共同存在的饲养水，雄性斑马鱼饲养水以及雌性斑马鱼饲养水进行了高效液相色谱分离分析。根据对三张高效液相色谱图对比分析，我们发现雄性斑马鱼与雌性斑马鱼共同存在时的饲养水包含了它们单独存在时饲养水中的所有物质。但是峰值的面积却不是雄性和雌性斑马鱼峰图面积简单地相加，说明雌性斑马鱼与雄性斑马鱼共同存在时，相互促进同刺激，以及即存在视觉接触又存在雄性饲养水接触的双重刺激下，雌性斑马鱼被性吸引的百分比。结果显示，在对雌性斑马鱼的吸引中雄性斑马鱼饲养水的接触刺激相对于视觉接触刺激占据主导地位。
　　在斑马鱼产卵行为实验中，我们同样用处于性成熟野生型的雌雄斑马鱼进行视觉与雄性斑马鱼两种不同的刺激，用不可视不交流饲养水时自然状态下雌鱼的性吸引百分比作为空白对照，通过对比视觉与雄性斑马鱼饲养水两种不同刺激时，以及雌性斑马鱼在视觉与雄性斑马鱼双重刺激下，产卵的雌鱼数量，确定在引起雌性斑马鱼产卵的行为中雄性斑马鱼饲养水的刺激相对于视觉刺激占据主导地位。
　　第二部分中，我们对雄性斑马鱼和雌性斑马鱼共同存在的饲养水进行了色谱质谱联动分析。系统根据斑马鱼生殖系统中性信息素的相关研究，我们大胆假设了36种类固醇进行分析。根据GC-MS的分析结果，在雄性斑马鱼与雌性斑马鱼共同存在时的饲养水中，一定存在的类固醇有22种，可能存在的类固醇有10种。为了验证这些类固醇是否是吸引雌性斑马鱼的物质，我们用这些物质刺激雌性斑马鱼，记录了雌性斑马鱼的嗅觉电生理反应。结果表明，这22种类固醇都没有连续的嗅觉电生理反应，因此我们不能确定吸引雌性斑马鱼以及促进雌性斑马鱼产卵的物质是哪个类固醇。
　　彼此某些物质的分泌。为了确定吸引雌性斑马鱼以及引起产卵的物质，我们用斑马鱼三组饲养水样品（每组32个分离组份）的96个组分进行了雌性斑马鱼嗅觉电生理（EOG）实验。根据电生理结果发现，能引起雌性斑马鱼嗅觉电生理反应的组分存在于10min以及20min左右的有雄性斑马鱼存在的饲养水组分中。雄性斑马鱼与雌性斑马鱼共同存在时雌性斑马鱼具有很强烈的嗅觉电生理反应，并且比雄性斑马鱼鱼雌性斑马鱼单独相加更强烈，再次证明了他们共同存在时相互促进彼此某些物质的分泌。并且雌性斑马鱼对雄性斑马鱼饲养水的分离组分嗅觉电生理反应明显比对雌性饲养水的分离组份要强烈，说明吸引雌性以及促进雌性斑马鱼产卵的物质存在于雄性斑马鱼的饲养水中。
　　综合实验表明，雄性斑马鱼饲养水中存在可以吸引雌性斑马鱼，并且可以引起雌性斑马鱼产卵的性信息素。并且当雌性斑马鱼存在时，可以促进雄性斑马鱼分泌吸引雌性斑马鱼以及引起产卵的物质的分泌。这些物质可能存在于雄性斑马鱼的饲养水质谱图中的10min以及20min的物质或者混合物，这是我们接下来的研究方向。

目录

声明

引言

1.1 信息素的定义

1.2 信息素的特征及种类

1.3 斑马鱼简介

1.4 斑马鱼信息素的研究

第二章雄性斑马鱼饲养水存在吸引雌性的性信息素

2.1 材料与方法

2.2 雄性斑马鱼的饲养水吸引雌性的实验设计

2.3 雄性斑马鱼的饲养水吸引雌性的结果与讨论

2.4 雄性斑马鱼的饲养水吸引雌性小结

第三章雄性斑马鱼的饲养水引起雌性产卵

3.1 材料与方法

3.2 雄性斑马鱼饲养水促进雌性斑马鱼产卵

3.3 雄性斑马鱼饲养水促进雌性斑马鱼产卵小结

第四章雄性斑马鱼饲养水GC-MS定性分析以及EOG验证

4.1 实验材料与试剂

4.2 雄性斑马鱼饲养水GC-MS定性分析实验设计

4.3 雄性斑马鱼的饲养水样品处理

4.4 雄性斑马鱼饲养水GC-MS定性分析结果

4.5 雌性斑马鱼对GC-MS鉴定出的类固醇的EOG反应

4.6 雌性斑马鱼对GC-MS鉴定出的类固醇的EOG结果

4.7 雄性斑马鱼饲养水GC-MS定性分析实验小结

第五章斑马鱼饲养水中信息素的HPLC分离分析以及EOG验证

5.1 高效液相分析分离系统的建立

5.2斑马鱼饲养水高效液相色谱分离

5.3 高效液相分离和色谱质谱联用分析讨论

5.4 斑马鱼饲养水分离组分的嗅觉电生理反应

5.5 斑马鱼饲养水HPLC分离组分的嗅觉电生理反应结果

5.6 斑马鱼饲养水HPLC分析分离以及分离组分EOG小结

第六章总结

参考文献

附录：

致谢