外源性龙血素B和钠通道调制剂对胞内钙浓度的动态调制

摘要

本论文采用钙离子荧光成像技术，免疫印迹以及行为学的方法，分别对龙血素B引起大鼠背根神经节（DRG）细胞内钙离子上升的机制和东亚钳蝎毒素(BmK)对于大鼠脑突触体膜内钙离子变化的协同作用进行了研究。
　　 1．龙血素B可诱导大鼠DRG神经元胞内钙离子缓慢上调在本研究中，运用Fura-2荧光染色的方法观察了在急性分离的DRG神经元细胞上由血竭中活性成分龙血素B诱导的游离态钙离子的变化。结果发现，龙血素B会剂量依赖地引起DRG神经元胞内钙离子的上升。在细胞外液无钙的条件下可引起同样的效应，但胞内钙离子的上升幅度相对较小。这表明DRG细胞内钙离子的升高主要是由细胞外钙离子内流，而不是由于细胞器如线粒体和胞内钙库的钙离子释放产生的。
　　 另外，咖啡因和龙血素B共孵育也可诱导胞内钙离子的升高，但是其上升幅度明显小于单独施加咖啡因，提示龙血素B作用的靶器或通路与咖啡因诱导通路或靶器有所重叠。此外，与咖啡因，高钾溶液和辣椒素相比，龙血素诱导的DRG神经元胞钙离子的上升更加缓慢且持续时间较长。这些结果表明，龙血素B可稳定且与众不同地诱发DRG神经元胞内钙离子浓度升高。
　　 2．特异性钠通道调制剂BmKI和BmK IT2的药理协同作用在本研究中，运用Fura-2荧光染色方法分别观察了特异性钠通道位点3调制剂BmKI和特异性钠通道位点4调制剂BmK IT2单体以及共给药条件下引起脑突触体膜钙离子的变化，同时，运用免疫印记和行为学的方法的方法分别观察了BmK I和BmKIT2诱导胞外细胞信号调节激酶(ERK)磷酸化以及对大鼠惊厥发作的效应。结果发现，BmK IT2没有能力改变突触体膜钙离子浓度或致ERK磷酸化。但是，BmK IT2对于BmK I引起的突触体膜上钙离子的上升具有正协同作用，且10∶1的BmK I和BmK IT2组合在加药的前半段时间（0-7.5分钟）钙离子上升的速率最快。观察钙离子的下游靶点ERK发现，与单独施加BmK I相比较，共同施加BmK I和BmK IT2可以使得突触体膜内更加多的ERK磷酸化被激活。由于脑皮层中ERK磷酸化表达与癫痫的发作密切相关，本研究结果为BmK IT2正协同增强BmKI惊厥发作提供了另一有力证据。