芳香烃生物降解途径蛋白质组学研究

摘要

芳香烃是一种重要的有机物，在环境中分布广泛，对人类健康和生态环境具有很大危害性。由于芳香烃独特物理化学结构，采用微生物一生物技术途径治理、清除或降解转化芳香烃类化合物污染是一种有效的方法。在后基因组时代，生物学研究重心从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究，其中，以蛋白质的功能和相互作用为主要目标的蛋白质组学研究成为最近的一个热点。由于芳香烃是一种环境异生物质，微生物更多的是可能通过形成诱导酶系具备了新的代谢功能，同时，降解菌在实际环境中还面临多种污染因子的胁迫，通过对压力胁迫下降解菌蛋白质组学分析，能够识别压力应答的蛋白以及参与环境污染物代谢的酶，有助于我们深入了解生物降解的过程，也为探讨微生物的进化趋势和潜在的进化机制提供了证据。 本项研究以环境中典型的芳烃污染物为研究对象，筛选分离获得了具芳香烃降解能力的菌株；采用蛋白质组学的方法，分析了降解菌在不同压力胁迫下降解途径中的蛋白表达差异，在纳米水平，观察分析了降解菌在污染物胁迫下细胞膜表面结构的变化，并采用反向PCR等分子生物学方法，克隆与分析了降解途径中的诱导酶。本研究所获主要结论如下： (1)从东北老工业基地长期受石油与重金属污染的土壤中，分离获得了一株以菲为唯一碳源的高效降解菌株ZX16，通过形态、生理生化、分子生物学鉴定为溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)。菌株降解菲的特性研究结果表明，ZX16可耐受2500mg/L的菲，对1500mg/L的菲在72h内降解率为98.2％。不同的重金属离子对菌株的降解效能影响大小依次为cu<'2+>>Cd<'2+>>Zn<'2+>>Pb<'2+>。菌株在中性条件下生长良好，原子力显微镜观察结果表明，菌株在复合污染物胁迫下细菌体积、形态有显著变化，细胞表面结构也从粗糙趋向光滑。 (2)采用二维蛋白电泳分析了产碱假单胞菌SNZ28在龙胆酸诱导条件下的蛋白质表达差异。电泳结果显示了两者存在有15个蛋白点的差异。通过MALDI-TOF和Q-TOF分析，其中的12个蛋白质点与数据库中已知多肽片段有同源性。其中，P4点与青枯菌(RalstonIa sp．)龙胆酸1，2加双氧酶同源。该结果在蛋白质组学上证实了诱导型GDO酶的存在。 采用二维蛋白电泳分析了高效菲降解菌ZX16在菲、菲与镉复合诱导下，蛋白质表达差异，共获得了21个新表达的蛋白质点，20个增量表达的蛋白质点，差异蛋白质点MALDI-TOF/TOF的分析表明，降解菌表达有转录调控蛋白、热休克蛋白、可溶性蛋白等多种与降解有关的蛋白。 (3)根据对诱导性GDO酶的蛋白质点N端和Q-Tof测序的结果，设计了一对简并引物，克隆了诱导型GDO酶的片段，通过对此片段的分析，设计了逆向PCR引物，进行反向PCR。测序表明，获得了一段1，047bp与Ralstonia sp．U2的龙胆酸1，2-加双氧酶具有极高同源性的序列。研究结果揭示了SNZ28中存在诱导型GDO酶。对不同来源的GD0酶进行了比较研究，其结果对生物降解基因的进化研究提供了基础性的研究结果。

目录

文摘

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引言

第一章芳香烃的结构特点与生物降解

第一节芳香烃的种类、来源和危害

1芳香烃的种类

2芳香烃的来源

3芳香烃的危害

第二节芳香烃的生物降解途径

1芳香烃好氧降解路径

2芳香烃厌氧降解路径

第三节主要芳香烃的生物代谢途径

1苯的降解

2萘的生物降解途径

3菲的代谢途径

第四节芳香烃龙胆酸降解途径

1龙胆酸降解途径的主要方式

2经龙胆酸途径降解芳香烃的菌株

3降解途径的龙胆酸1，2加双氧酶

第五节芳香烃降解途径中调控因子的研究

1转录调控因子的种类与功能

2芳香烃代谢途径中的转录调控因子

第六节芳香烃生物降解途径中影响因子

1混合芳烃对微生物降解的影响

2碳源和能源对芳烃生物降解的影响

3氧气对生物降解的影响

4重金属离子对生物降解的影响

第二章蛋白质组学方法在芳香烃生物降解代谢途径研究中的应用

第一节蛋白质组与功能蛋白质组学

1蛋白质组的研究内容

2蛋白质组学的主要研究策略与技术路线

3蛋白质组学的主要研究技术

第二节蛋白质组学分析方法在芳香烃降解途径研究中的应用

1蛋白质组学技术在降解代谢途径研究中的应用

2蛋白质组学技术在压力应答研究中的应用

第三节 项目研究的目的任务

第三章高效菲降解菌的分离筛选与特性研究

第一节材料与方法

1试剂与培养基

2菌株分离和鉴定

3菲的降解特性

4底物降解范围

5初始pH值变化的影响

6重金属离子对菌株降解效能的影响

7复合污染物条件下降解菌细胞表面结构观察

第二节结果

1菌株的分离与鉴定

2菌株降解菲的特性

3底物的利用与降解

4初始pH值变化的影响

5重金属离子对菌株降解效能的影响

6复合污染物条件下降解菌细胞表面结构观察

第三节讨论

第四章芳香烃降解途径蛋白质组学研究

第一节芳香烃生物降解过程蛋白质表达差异研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节复合污染条件下菲降解途径蛋白质组学研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第五章芳香烃生物降解途径酶的克隆与研究

第一节材料与方法

1菌株、试剂与培养基

2双向电泳与质谱分析参照前文方法

3数据分析与数据库检索参照前文方法

4蛋白质点N端测序

5诱导型GDO酶的克隆与测序

第二节结果

1 N端序列测定与MS-BLAST检索结果

2 GDOII核酸扩增结果与测序结果

第三节分析与比较

1 GDOI与GDOII酶的序列比较

2 GDO酶核心区保守序列分析

3来源于不同菌株的GDO酶的同源关系分析

4来源于不同菌株的GDO酶二级结构分析

第四节讨论

第六章结论与展望

博士期间发(待发)表论文

附录

参考文献

后记

致谢