尿囊酸酶基因在盘基网柄菌多细胞发育中功能的初步研究

摘要

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是一种单细胞真核生物,以细菌和酵母为食。在营养丰富的条件下,以二分裂方式繁殖生长；当食物逐渐耗尽后,经过聚集、细胞丘、蛞蝓体、子实体四个阶段聚集成一个多细胞有机体。这个过程是在cAMP振荡梯度信号的作用下开始,在众多粘附分子和信号分子的参与下完成的。与高等生物胚胎发育相似,盘基网柄菌的多细胞发育也经历一系列形态发生和细胞分化。盘基网柄菌的多细胞发育尽管相对简单,但涉及到一系列生化过程与高等生物十分相似,因此可以作为一种良好的模式生物来研究多细胞发育、细胞凋亡等过程中的信号分子调控。 gp150蛋白是一种膜蛋白,由LagC基因编码,在细胞与细胞接触区域特别丰富,它通过异嗜性相互作用来调节细胞间的紧密黏着。突变型细胞株AK127是由野生型细胞株KAx-3剔除lagC基因得到的,它不能完成多细胞发育,发育只能停留在细胞松散聚集阶段。由此推测,gp150蛋白在盘基网柄菌发育过程中起着重要作用,它可能参与介导细胞分化和凋亡的信号转导途径,但具体的信号通路至今仍未完全清楚。 在研究gp150的过程中,本实验室人员筛选到与盘基网柄菌发育调控相关的基因片段(GenBank登陆号:AY894718)。经blast分析,该片段是尿囊酸酶基因的一个片段。尿囊酸酶是嘌呤代谢中一种重要的酶,在灵长类、鸟类以及昆虫体内,嘌呤经过代谢最终以尿酸的形式排出体外；而在微生物、两栖动物和鱼中,尿酸则会继续水解为尿囊酸。尿囊酸在尿囊酸酶催化下生成脲基乙醇酸和尿素,而脲基乙醇酸会最终水解为氨气、二氧化碳和乙醛酸。有报道认为氨可能通过抑制诱导分化因子来调控盘基网柄菌细胞的分化,所以氨可能是盘基网柄菌细胞发育调控中一种重要的信号分子,但是其具体的调控作用还不是很清楚。 RNA干扰技术(RNAi)是研究这些问题的重要手段,该技术是将外源或内源性的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制其相应的基因表达,是一种转录后基因沉默。在哺乳动物体内,一般都用小于30nt的dsRNA进行RNAi研究,而在一些非哺乳动物中,有些学者认为用长dsRNA进行研究较好,因为长的dsRNA具有较强的抑制效果。但构建长dsRNA表达载体难度较大,不易成功。本实验在构建长dsRNA表达载体方面作了探索,获得较满意的结果。本实验先通过提取野生型发育14h细胞的总RNA、反转录合成第一链cDNA后,通过PCR反应扩增出约400bp和600bp两个DNA片段。两片段经过回收后分别克隆到pMD18-T载体中,经测序后得到如下结果：两个片段大小分别为397bp和642bp,这两个片段具有相同的起始位点,并且短片段的序列与长片段序列的前397bp是一致的。将这两个基因片段反向插入表达载体pAct15Gal中,构建了用于尿囊酸酶基因RNAi的载体。 用HL5培养基液体无菌培养盘基网柄菌细胞后,通过磷酸钙法或者电转化法将构建好的载体转化盘基网柄菌细胞,利用G418抗性进行筛选。在含有G418抗性的平板上7-12天可以长出阳性单克隆,阳性单克隆是一个类似菌落的小点,在倒置显微镜下观察发现,单克隆的状态犹如盘基网柄菌发育到细胞丘阶段的形态。这个形态结构即是单克隆的最终形态结构,因为即使在平板上更长的时间,也不会形成含孢子的子实体。 根据这一现象推测,通过RNAi沉默尿囊酸酶基因后,整个和发育过程相关的信号网络受到破坏,致使盘基网柄菌不能发育成孢子。所以尿囊酸酶在盘基网柄菌的细胞信号转导中起到很重要的作用。然而,涉及到具体途径和蛋白分子还需进一步的实验验证。本论文的研究为进一步研究尿囊酸酶基因功能及其在盘基网柄菌信号转导中的作用奠定了基础,也为盘基网柄菌整个信号通路的研究做出了贡献。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.RNAi及其实验技术

2.盘基网柄菌多细胞发育期的细胞粘附

3 gp150对盘基网柄菌细胞发育的调控

4.本文的立论依据和研究意义

第二章盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)野生型(Kax-3)细胞与突变型(AK127)多细胞发育阶段形态发生的比较

1引言

2实验材料

3实验方法

4实验结果

5分析和讨论

第三章尿囊酸酶基因RNAi载体的构建

1.引言

2实验材料

3.实验方法

4.实验结果

5分析和讨论

第四章盘基网柄菌液体培养及载体转化

1引言

2实验材料

3实验方法

4、实验结果

5、分析和讨论

参考文献

致谢