骨髓间充质干细胞应用于骨组织缺损修复的研究

摘要

骨髓间充质干细胞应用于骨组织缺损修复的研究博士后薄斌合作导师范明王常勇军事医学科学院基础医学研究所100850摘要由于肿瘤、外伤和骨骼异常等原因引起的大段骨缺损往往需要骨的重建。组织工程化骨组织的研究为骨缺损修复开辟了新的途经。本研究应用组织工程方法对骨组织缺损修复再造进行了系列探讨。研究内容包括(骨髓间充质干细胞)MSCs的生物学特性与成骨诱导分化、MSCs复合β-TCP体外成骨潜能以及MSCs复合β-TCP用于骨组织缺损修复等几个方面。 1.人骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特征目的：了解体外培养的人骨髓MSCs一般细胞生物学特性。方法：抽取人骨髓标本5ml，采用比重为1.073g/ml的Percoll梯度离心制备单个有核细胞。按5.0×105/ml浓度接种于无菌的25cm2塑料培养瓶中，培养体系为含10％FBS的低糖DMEM。利用多孔培养板采用MTT法分别对培养的MSCs进行细胞生长曲线测定。通过流式细胞仪技术测定MSCs的细胞周期，并选用抗CD29、CD44、CD45和HLA-DR单克隆抗体，对培养的MSCs进行表型鉴定。结果：培养的MSCs为纺锤状，呈克隆样生长。原代培养的MSCs克隆数目平均为43±11个。流式细胞仪检测结果显示，培养的各代细胞对CD44和CD29表面抗原有着较高水平的阳性表达率，而对于CD34和HLA-DR表面抗原的阳性表达率却很低。G0/G1、S和G2/M期细胞的比例分别为88.17％、6.57％和5.27％。结论：培养的细胞不是骨髓造血干/祖细胞，而是一群均一的间充质干细胞，具有独特的增殖和表型特征。 2.体外培养人骨髓间充质干细胞成骨潜能的实验研究目的：探讨人骨髓MSCs体外培养、向成骨细胞分化的条件，为MSCs作为种子细胞应用于骨组织工程研究奠定基础。方法：采用比重为1.073g/ml的Percoll细胞分离液从人骨髓中分离单个有核细胞进行MSCs培养，培养液为含10％胎牛血清的L-DMEM。应用流式细胞仪对培养的MSCs进行表型鉴定。在培养液中添加100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠和0.25mM抗坏血酸对培养第3代的MSCs进行成骨诱导培养。连续观察MSCs向成骨细胞转化过程中的形态学变化，在一定时间间隔通过碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色以及VonKossa染色方法对诱导培养的MSCs进行细胞生物学特性研究。应用X线衍射仪对诱导培养后形成的细胞外矿化基质进行物质成分分析。应用RT-PCR检测诱导分化后的细胞骨钙素mRNA的表达。对照组选择未添加诱导液培养的MSCs进行上述各项指标的检测。结果：采用Percoll从人骨髓中分离培养的细胞符合MSCs表型特征，具有较高的纯度。经诱导培养的MSCs随着时间的延长，多角型细胞逐渐增多并聚集成团，同时在细胞周围出现点片状钙化斑，最终形成广泛均一的矿化结节样结构。免疫组化和组织化学染色显示经过诱导处理的MSCs表现为Ⅰ型胶原阳性、ALP阳性和细胞外钙沉积，而未经诱导的MSCs均为阴性。x线衍射分析证明，细胞外矿化基质为羟基磷灰石，它是构成无机骨质的重要成分。RT-PCR检测表明诱导分化后的细胞表达骨钙素mRNA。结论：人骨髓MSCs可以在体外定向分化为成骨细胞，并具备成骨细胞的表型和功能，从而建立了一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。 3.骨髓间充质干细胞在β-磷酸三钙陶瓷内生长和成骨潜能的研究目的：明确在实验室条件下培养体系中MSCs细胞在β-TCP三维结构中附着、增生和分化的生物学特点以及形成骨组织的可能性。方法：用比重为1.073g/ml的Percoll梯度离心人新鲜骨髓，收集单个有核细胞进行MSCs培养。将培养的MSCs制备成3×106/ml的细胞悬液，在96孔培养板中每孔取200μl与β-TCP复合。在培养液中添加100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠和0.25mM抗坏血酸对MSCs进行成骨诱导培养。分别于第1、7、14、21天每次取3孔在酶联免疫检测仪上进行MTT比色试验，绘制MSCs在材料中的细胞生长曲线。分别于第5、10、15、20天对复合培养的上清液进行碱性磷酸酶含量测定。应用扫描电镜观察MSCs在材料中的生长情况，并对复合物表面的细胞外基质成分采用x线能谱衍射法进行元素成分分析。将培养一定时间的复合物制备成组织切片标本，进行HE染色观察。结果：扫描电镜和生长曲线观察表明MSCs在β-TCP材料中生长良好。复合物在有诱导剂存在的培养体系中有较高的碱性磷酸酶活性表达，并随培养时间延长而增加，与非诱导培养体系比较，具有显著性差异(P＜0.01)。培养30天的复合体组织切片中可以显示类骨质的产生以及成骨细胞被包埋在新形成的骨基质中。x线能谱衍射分析显示细胞外基质中的结晶物质主要由钙、磷元素构成。结论：所建立的MSCs-β-TCP培养体系中有三维骨组织形成，为利用MSCs和β-TCP进行组织工程化骨组织的体外构建以及进一步体内植入研究提供了相关的实验依据。 4.骨髓间充质干细胞复合-多孔磷酸钙陶瓷修复颅骨缺损的实验研究目的：探索以MSCs作为种子细胞、β-TCP作为支架材料来构建组织工程化人工骨修复兔实验性颅骨标准缺损的可行性。方法：实验分三组。A组(n=12)：分离培养兔同胎异体骨髓间充质干细胞，体外扩增后接种到预制的灭菌处理的β-磷酸三钙(β-TCP)多孔生物陶瓷材料上，细胞-材料复合体经体外孵育后，在无菌条件下植入同胎兔实验性颅骨标准缺损处；B组(n=12)：采用单纯β-TCP材料修复兔实验性颅骨标准缺损；C组(n=4)：兔实验性颅骨标准缺损区未做任何修复。术后4周和16周分别取材，进行缺损区组织化学分析。结果：A组颅骨缺损处表面肉眼可见骨样组织形成，组织学观察提示，术后4周时材料部分降解，未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生骨组织，且成骨细胞外基质丰富。术后16周，支架材料几乎完全降解，缺损区被新生骨组织所替代。B组术后4周，可见从缺损区边缘有新生骨组织向支架材料内长入，支架材料部分吸收。至术后16周，可见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生骨组织逐渐增多，但材料的中心部位未发现新生骨形成。C组术后16周，仅见少量骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入，缺损中央大部分区域仍未得到修复。结论：体外培养扩增的兔MSCs在不添加外源性生长因子的情况下，与TCP复合植入后可以在体内诱导、分化为成骨细胞并能够对标准的颅骨缺损进行有效的修复，可以进一步推广到临床应用。 综合上述实验，分离培养的MSCs纯度高、形态和表型均一，可以在体外定向分化为成骨细胞，因此，有条件成为骨组织工程应用的种子细胞。MSCs在多孔磷酸钙陶瓷内生长及其成骨潜能为MSCs复合β-TCP构建组织工程骨用于骨组织缺损研究提供了生物学基础。MSCs复合β-TCP对兔颅骨缺损的有效修复为临床应用奠定了实验基础。

目录

缩略语

前言

实验一人骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特征

实验二体外培养人骨髓间充质干细胞成骨潜能的实验研究

实验三骨髓间充质干细胞在多孔磷酸钙陶瓷内生长和成骨潜能的研究

实验四骨髓间充质干细胞复合-多孔磷酸钙陶瓷修复颅骨缺损的实验研究

总结

致谢

博士后期间发表论文

文献综述 骨髓间充质干细胞与骨组织工程

参考文献

附图