乙型肝炎病毒e抗原相互作用蛋白基因的克隆化及功能的初步研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝细胞损伤的机制,与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用密切相关.而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前-C基因区编码的一种非颗粒性的分泌蛋白,随HBV复制而增加,临床上将其作为判断HBV活动性复制的指标之一.因此研究HBeAg与肝细胞内蛋白的相互作用及其机理,能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释,并为寻找有效防治方法提供新线索.酵母双杂交技术是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的方法.该实验所采用酵母双杂交系统-3,基于两种单倍体酵母a和α型可以配合形成二倍体,而其中表达的外源蛋白仍能相互作用的机理,免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题,大大提高了杂交效率;在原技术基础上增加了3个报告基因,降低了假阳性率.我们利用该技术,根据中国HBV流行株序列设计引物,应用多聚酶链反应(PCR)技术,由乙型肝炎患者血清中分离出HBeAg编码基因序列.为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与HBeAg在体外也存在相互作用,我们根据Genbank中提供的序列信息设计引物,以HepG2细胞的mRNA为模板,通过逆转录-PCR扩增出CD81及新基因AK026018的全序列,测序鉴定后,经相应的限制性内切酶消化后,克隆入酵母表达载体pGADT7,在TNT网织红细胞裂解物中进行体外翻译,掺入同位素<'35>S,与HBeAg进行体外免疫共沉淀反应,经SDS-PAGE电泳,-20℃条件下放射自显影,再次证实上述蛋白间结合作用的可靠性.在新基因功能的研究方面,我们对HBeAg结合蛋白新基因AK026018进行了初步探讨.

目录

引言

第一部分：重组DNA结合域载体的构建与表达

1实验材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分：酵母双杂交筛选肝文库中HBeAg结合蛋白基因

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

第三部分：CD81及未知功能基因AK026018的克隆化及体外免疫共沉淀实验

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

第四部分：CD81、未知功能基因AK026018对HBeAg表达的影响及AK026018基因功能的初步研究

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

结论

参考文献

缩写字母中英文全称

乙型肝炎e抗原的相关研究

酵母双杂交系统的研究进展

攻读博士学位期间发表的论文

致谢