猪卵母细胞孤雌激活、胚胎培养和成熟过程中细胞因子作用的研究

摘要

猪卵母细胞的体外成熟培养、成熟卵母细胞的孤雌激活和胚胎培养是胚胎生物工程技术的主要环节。研究猪卵母细胞发育的基础技术和相关机理正逐渐受到人们的关注。猪卵母细胞体外成熟培养、孤雌激活和胚胎培养条件的优化和相关机理的阐明对于体细胞核移植和转基因动物构建具有重要意义。目前，国内外在这几个方面作了相关的研究，但其研究尚不成熟，影响了我们即将开展的猪体细胞核移植和相关机理研究的开展。为此，本实验对猪卵母细胞体外成熟培养、成熟卵母细胞的孤雌激活、孤雌激活胚胎的体外培养和卵母细胞成熟过程中细胞因子的作用以及IGF-Ⅰ促进卵母细胞成熟的机理作了研究，以建立卵母细胞体外发育的技术平台，为转基因猪的研制和猪卵母细胞发育和克隆相关机理的研究奠定基础。 本研究分为4个部分，第一部分对影响猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后胚胎分裂的几个重要条件进行了比较研究，确立了一种较好的培养方法：与颗粒细胞共培养，找到了一种适合猪卵母细胞体外成熟的培养基：mNCSU-23+15IU/mlPMSG+20IU/mlHCG+15％PFF+0.57mM半胱氨酸，成熟率和分裂率分别为(86.7±3.35)％和(86.3±4.16)％，国外报道的最高成熟率为(85.7±4.1)％；第二部分对猪卵母细胞孤雌激活的化学方法进行了研究，确立了化学激活猪卵母细胞的两种最佳方法：1)将成熟的去卵丘颗粒细胞的MⅡ期卵母细胞用20μmol/Lionomycin(离子酶素)作用30min，再将卵母细胞培养于含5μg/mlCB(细胞松弛素)和5mM/L6-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤)的NCSU-23培养液中，卵裂率和桑囊胚发育率达到(76.7±7.6)％和(37.1±6.4)％2)将成熟的去卵丘颗粒细胞的MⅡ期卵母细胞在200μM/L的Thimerosal(乙基汞硫代水杨酸钠)中处理20min，再与8mM的DTT(二硫苏糖醇)共孵育30min，卵裂率和桑/囊胚形成率为(81.0±2.8)％和(39.6±2.7)％；第三部分对孤雌激活胚胎的培养条件进行了研究，确立了一种最佳的胚胎培养条件：在SOF简单培养基中添加颗粒细胞进行前3天的培养，然后转入添加胎牛血清的NCSU-23培养基并和输卵管上皮细胞进行后期的培养，其桑椹胚和囊胚的发育率为(59.5±3.2)％；第四部分研究了IGF-Ⅰ、bFGF、TGF-α三种细胞因子单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后卵裂的影响，并对IGF-Ⅰ促进猪卵母细胞成熟的机理进行了初步探讨。结果发现：1)将卵母细胞分别培养于含20ng/ml的IGF-Ⅰ、20ng/mL的bFGF、15ng/mL的TGF-α的NCSU-23中，成熟率和卵裂率最高，分别为[(85.3±2.11)％，(85.4±2.81)％]，[(85.0±1.70)％，(85.0±2.82)％]，[(86.9±0.46)％，(86.3±2.01)％]2)15ng/mLTGF-α和20ng/mLbFGF联用组，卵母细胞成熟率和卵裂率最高，分别为[(89.2±1.44)％，(88.8±0.17)％]，IGF-Ⅰ和bFGF、TGF-α有部分撷颃作用，bFGF和TGF-α对卵母细胞的成熟有协同作用。3)在卵母细胞成熟过程中，添加20ng/mlIGF-Ⅰ组与对照组相比，卵母细胞减数分裂成熟的时间缩短了，体外成熟的发育进程加快。4)在未添加IGF-Ⅰ组，Erk1/2激酶在卵母细胞培养过程中的18h开始表达，表达量随着卵母细胞的成熟不断增加，在36h达到最大值，此后一直保持稳定，直到42h卵母细胞成熟；Akt激酶在卵母细胞成熟的24h开始表达，表达量也随着培养时间的延长而增加，当36h时侯，表达量达到最大，以后保持稳定，直到42h卵母细胞成熟。当在培养液中添加20ng/mlIGF-Ⅰ后，在成熟培养14h就检测到了ERK1/2的活性，并在32h达到顶峰，直到42h培养结束；12h就检测到了Akt激酶的活性，并在28h达到最大，此后激酶的表达量不变化。

目录

摘要

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前 言

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

5图片

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

5图片

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

总 结

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致 谢

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