角质细胞特异性Smad4剔除小鼠脱毛并发生皮肤癌

摘要

TGF-β超家族分子在调节细胞增殖、谱系分化、迁移、黏附和凋亡过程中具有重要作用。Smad4分子是TGF-β超家族分子信号通路的中心介导者。为了进一步深入研究TGF-β超家族分子在皮肤发育过程中的功能，我们利用Cre-IoxP系统研制了角质细胞特异性Smad4剔除小鼠。 利用SouthernBlot和ROSA26报告小鼠研究了角质细胞特异性Cre重组酶(K5-Cre)转基因小鼠中Cre重组酶表达的组织特异性。结果显示，Cre重组酶表达于所有含有角质细胞的组织中，表明角质细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠可以作为在角质细胞进行基因剔除的工具小鼠。将该小鼠和Smad4条件基因打靶小鼠交配，得到角质细胞特异性Smad4剔除小鼠。半定量RT-PCR结果显示，在基因剔除小鼠的表皮几乎检测不到Smad4的转录本，说明K5-Cre介导的重组在角质细胞中有效地阻断了Smad4的表达。 Smad4剔除小鼠从出生后第20天开始进行性毛发脱落。系统的组织病理学分析结果显示Smad4剔除小鼠皮肤基底层明显增厚、毛囊肥大且不能进入退化期。TUNEL检测结果显示，Smad4剔除小鼠退化期角质细胞不能发生正常凋亡，使突变毛囊不能启动退化期并影响毛囊的正常周期循环。BrdU掺入法测量出生后10天、20天小鼠角质细胞的增殖程度，发现基因剔除小鼠中角质细胞的增殖能力明显升高。70％Smad4剔除小鼠在12月龄前发生皮肤肿瘤，其中60％为鳞状细胞癌，而对照小鼠肿瘤发生率为0％。通过原位杂交，只能在基因剔除小鼠退化期毛囊检测到Shh的表达。免疫组织化学检测结果显示，c-myc，cyclinD1在基因剔除小鼠毛囊及肿瘤组织中表达升高，而p21表达降低。这些分子的改变引起表皮和毛囊角质细胞过度增殖，导致毛囊周期紊乱并发生皮肤癌。 我们的实验结果在国内外首次提供体内的遗传学证据证明Smad4分子是维持毛囊周期循环和抑制皮肤肿瘤所必须的。角质细胞特异性Smad4剔除小鼠的成功研制为进一步深入研究Smad4介导的TGF-β信号在皮肤发育过程中的作用和机制奠定了基础。该小鼠还可以作为皮肤癌发病机理研究以及药物筛选和治疗方案评价的模型小鼠。

目录

摘要

引言

1.1皮肤、毛囊结构及毛囊周期循环

1.2 TGF-β超家族分子信号传导途径

1.3 TGF-β超家族分子在毛囊周期循环中的作用

1.4 TGF-β与生长控制

1.5 TGF-β与凋亡

1.6 TGF-β与肿瘤

1.6.1 TGF-β在肿瘤发生过程中扮演两种截然不同的角色

1.6.2肿瘤中TGF-β受体的突变

1.6.3肿瘤中Smad的突变

1.7研究的目的和意义

第一部分 角质细胞特异性Smad4剔除小鼠的获得

1材料和方法

1.1实验动物

1.2小鼠基因组DNA的制备

1.3基因型鉴定

1.4 LacZ染色

1.5石蜡包埋、切片及复染

1.6角质细胞特异性Smad4剔除小鼠的获得和基因型鉴定

1.7 Southern Blot

1.8 RT-PCR

2结果

2.1 K5-Cre转基因小鼠中Cre重组酶的表达分布

2.2角质细胞特异性Smad4剔除小鼠的获得

3讨论

第二部分 角质细胞特异性Smad4剔除小鼠脱毛并发生皮肤癌

1材料和方法

1.1 HE染色和免疫组织化学

1.2 BrdU掺入法检测增殖

1.3普通原位杂交

2结果

2.1角质细胞特异性Smad4剔除小鼠发生进行性脱毛

2.2角质细胞特异性Smad4剔除小鼠毛囊不能进入退化期

2.3角质细胞特异性Smad4剔除小鼠表皮和毛囊过度增生

2.4角质细胞特异性Smad4剔除小鼠发生皮肤癌

3讨论

结论

参考文献

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致谢