胸腺淋巴细胞分化与Notch信号转导通路的关系及六味地黄汤的作用研究

摘要

本研究重点观察了SAMP8增龄过程中胸腺淋巴细胞免疫功能的动态变化过程，进而研究了Notch信号转导通路信号分子基因表达与胸腺淋巴细胞分化的关系，并初步观察了LW及其拆方对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响，其目的在于探讨衰老过程中免疫系统的衰老与Notch信号转导通路的关系，从而进一步认识免疫衰老的机理及发展过程。 本研究分为四个部分：(1)增龄过程中SAMP8胸腺结构和T细胞功能的变化；(2)增龄过程中SAMP8胸腺淋巴细胞分化的动态变化；(3)增龄过程中SAMP8胸腺淋巴细胞Notch通路信号分子基因表达的动态变化；(4)LW及其拆方“三补(SB)”和“三泻(SX)”对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响。 一、增龄过程中SAMP8胸腺结构和T细胞功能的变化胸腺是中枢免疫器官，是T细胞分化成熟的场所，衰老过程中胸腺的结构和功能发生明显变化，以胸腺增龄性萎缩表现尤为明显。胸腺萎缩又不可避免地影响依赖于胸腺的T细胞分化，进而影响向外周淋巴器官输出成熟T细胞的数量和功能。因此，本研究首先观察了SAM增龄过程中胸腺组织结构和胸腺淋巴细胞增殖反应的变化。 实验结果表明，SAMR1和SAMP8出生后胸腺均逐渐增大，至4周龄时体积最大，此后开始萎缩，8周龄时萎缩已十分明显。在4周龄以前，SAMP8胸腺重量和组织结构与SAMR1相比无明显差异。6周龄时SAMR1和SAMP8的胸腺重量均有所减轻，SAMP8更为明显，其重量明显低于SAMR1。组织切片可见SAMP8胸腺皮质明显变薄，细胞数量减少；8周龄时SAMP8胸腺重量进一步下降，胸腺皮质明显变薄，细胞数量进一步减少。上述结果表明，SAMP8胸腺萎缩明显早于SAMR1，萎缩程度明显重于SAMR1。 进一步观察了增龄过程中SAM胸腺淋巴细胞增殖反应的变化。结果表明，6周龄前SAMR1和SAMP8胸腺淋巴细胞增殖反应均表现为随增龄而增强，6到8周龄无明显变化；1、2周龄时SAMR1和SAMP8间无明显差异，自4周龄开始，SAMP8胸腺淋巴细胞增殖反应能力明显低于同龄SAMR1，提示其功能开始降低。 二、增龄过程中SAMP8胸腺淋巴细胞亚群分化的动态变化小鼠胸腺淋巴细胞的分化过程主要是由CD4-CD8-双阴性(Doublenegative，DN)到CD4+CD8+双阳性(Doublepositive，DP)、再到CD4+(Singlepositive，SP)或CD8+单阳性的过程，其中CD4+单阳性是T辅助性细胞(helperTlymphocyte，Th)，CD8+单阳性主要是T抑制性细胞(suppressorTlymphocyte，Ts)和细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，Tc)，但近年来研究发现，CD8+单阳性细胞中也含有具有辅助功能的T细胞亚系。此外，目前普遍认为，CD28是免疫细胞衰老的标志性分子。因此，本研究运用流式细胞技术(Flowcytometry，FCM)，观察了增龄过程中SAM胸腺淋巴细胞亚群的变第3页化。 结果表明，在增龄过程SAMR1和SAMP8胸腺细胞分化的动态过程相似。与同龄SAMR1相比，SAMP8胸腺CD4+CD8+双阳性细胞的比例变化过程无明显差异，CD4+单阳性细胞的比例在6周龄前与SAMR1无明显差异，在8周龄时低于SAMR1，但CD8+单阳性细胞比例在4周龄时开始明显高于同龄SAMR1，因而导致其CD4+/CD8+比值降低，提示4周龄时SAMP8开始出现免疫功能平衡失调。此外，1至8周龄SAMP8胸腺细胞CD28分子的表达量均明显高于同龄的SAMR1。提示SAMP8胸腺细胞的衰老程度明显高于SAMR1，可能是其亚群分化失调和功能低下的重要原因之一。 三、SAMP8增龄过程中胸腺淋巴细胞Notch通路信号分子基因表达的动态变化 本研究应用流式细胞术和实时定量反转录聚合酶链反应(Real-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction，Real-timequantitativeRT-PCR)检测了不同周龄SAMP8和SAMR1胸腺淋巴细胞Notch信号转导通路中Notch1、PS1、PS2、HES1基因mRNA表达的动态变化，并分析了它们与CD8+细胞动态变化的相关性。 研究结果表明，SAM在增龄过程中胸腺细胞Notch通路信号分子的基因表达发生了相应的变化，其中Notch1、PS2、HES1的表达随增龄逐渐增加，而PS1则随增龄逐渐降低；对CD8+细胞比例与上述信号分子基因表达进行相关性分析结果显示，CD8+细胞的分化与Notch1、PS2、HES1表达变化呈正相关的关系，而与PS1基因表达呈负相关的关系，提示衰老过程中胸腺淋巴细胞亚群的分化与Notch信号转导通路中信号分子的表达具有密切关系，不同信号分子对胸腺细胞分化具有不同的调节作用。此外，研究发现，SAMP8胸腺细胞Notch1的表达在1至8周龄时均明显高于同龄SAMR1，PS2和HES1基因均自4周龄起明显高于同龄SAMR1，而PS1基因自4周龄起则明显低于同龄SAMR1。提示Notch信号转导通路中信号分子基因表达异常可能是导致增龄过程中SAMP8胸腺细胞功能衰退、亚群分化异常的重要原因之一。 四、LW及其拆方对不同小鼠胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响 1.LW及其拆方对正常小鼠胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响 (1)对正常小鼠胸腺淋巴细胞亚群及CD28表达的影响分别口服给予4周龄Ba1b/c小鼠LW(5、10及20g/kg)、SB(6.4g/kg)和SX(3.6g/kg)，连续2周，然后观察胸腺淋巴细胞亚群的变化。结果表明，LW及SB和SX对正常小鼠CD4+CD8+细胞和CD4+细胞的比例均无明显影响；三个剂量的LW均使胸腺CD8+细胞的比例明显增高，其中以10g/kg剂量的作用最明显，并使CD4+/CD8+比值明显降低。SB和SX对CD8+细胞比例无明显影响。LW在低、中剂量时以及SB和SX均能使胸腺淋巴细胞CD28表达增加，其中以LW低剂量时作用最强，大剂量LW对此则无明显影响。 (2)对正常小鼠胸腺淋巴细胞Notch通路信号分子基因表达的影响LW及SB、SX的给药剂量和方式同上。结果表明，LW(5、10及20g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)对正常小鼠胸腺淋巴细胞Notch1和PS1基因表达水平无明显影响。但三个剂量的LW均使PS2和HES1基因的表达水平明显增高，且具有一定的量效关系；SB和SX对PS2、HES1基因的表达水平无明显影响。 2.LW及其拆方对SAMP8胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响 (1)对SAMP8胸腺淋巴细胞亚群及CD28表达的影响本实验观察了口服给予LW及SB、SX对4周龄SAMP8胸腺淋巴细胞亚群的影响。实验结果表明，连续4周口服给予LW(10g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)，对SAMP8胸腺CD4+CD8+细胞比例无明显影响。LW可使SAMP8胸腺CD4+细胞比例有所增加，但无统计学差异；SB和SX对CD4+细胞比例无明显影响。LW及SB可明显降低SAMP8胸腺CD8+细胞比例，使CD4+/CD8+比值增高，但SX对CD8+细胞比例无明显影响。此外，LW、SB及SX均能明显增加CD28的表达，其中以SB(6.4g/kg)的作用最强，LW次之。 (2)对SAMP8胸腺淋巴细胞Notch通路信号分子基因表达的影响观察口服给予LW及SB、SX对Notch通路信号分子基因表达影响的实验结果表明，连续4周口服给予LW(10g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)，对SAMP8胸腺淋巴细胞Notch信号转导通路上的四种信号分子的基因表达具有不同的作用。LW、SB及SX对Notch1和PS1基因表达水平无明显影响，但可不同程度地降低PS2和HES1基因的表达水平，其中以LW的作用最强。 以上结果表明，LW使正常小鼠胸腺CD8+细胞的比例明显增高，CD4+/CD8+比值明显降低，但其却使SAMP8胸腺CD8+细胞比例明显降低，CD4+/CD8+比值增高，SB对SAMP8的影响与LW相似，表明LW对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞亚群的分化具有不同的的作用。在对胸腺淋巴细胞Notch通路信号分子基因表达的影响上，LW使正常小鼠的PS2和HES1基因表达水平明显增高，但LW、SB及SX则使SAMP8的PS2和HES1基因表达水平明显降低，表明LW及其SB、SX拆方对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞的Notch通路信号分子基因的表达也具有不同的影响，但分别与对胸腺CD8+细胞的作用一致。

目录

英文缩略词表

第一章前言

第二章材料与方法

第三章实验结果

一、增龄过程中SAMP8胸腺结构和T细胞功能的变化

二、SAMP8增龄过程中胸腺淋巴细胞分化的动态变化

三、SAMP8增龄过程中胸腺淋巴细胞Notch通路信号分子基因表达的动态变化

1.胸腺淋巴细胞Notch1基因表达的动态变化

2.胸腺淋巴细胞PS1基因表达的动态变化

3.胸腺淋巴细胞PS2基因表达的动态变化

4.胸腺淋巴细胞HES1基因表达的动态变化

5.胸腺CD8+细胞亚群与Notch1、PS1、PS2、HES1基因表达量的相关性分析

四、LW及其拆方对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响

1.LW及其拆方对正常小鼠胸腺淋巴细胞亚群及Notch通路信号分子基因表达的影响

2.LW及其拆方对SAMP8胸腺淋巴细胞亚群及Notch信号分子基因表达的影响

第四章讨论

第五章结论

参考文献

Notch 信号传导通路与细胞分化的关系研究（文献综述）

个人简历

致 谢