原核高效可溶性表达载体的构建及初步应用

摘要

利用大肠杆菌生产多肽类药物具有成本低，周期短且不存在病毒致癌基因污染等优点，所以大肠杆菌是目前基因工程中细胞因子和多肽类药物生产的主要工程菌。但大多外源基因在大肠杆菌中表达时往往以包含体形式存在，这就造成复性的困难和成本的提高。原核生物表达系统缺乏真核细胞特有的加工后处理；高度还原环境大肠杆菌胞质使表达的重组蛋白往往不能形成正确的二硫键与完整的四级结构都使得重组蛋白的活性较低。因此如何获得高效可溶性并具有类似天然生物活性的重组蛋白是利用大肠杆菌进行基因工程技术的关键。大肠杆菌胞间质内的Dsb(二硫键氧化还原酶)家族使得胞间质内氧化电势较高为形成二硫键提供了有利条件。利用Dsb家族和目的蛋白融合表达具有让外源蛋白周质腔定位并辅助其正确形成二硫键和空间结构的功能。 本课题基于以往的研究基础，利用Dsb蛋白家族的功能和特性构建了串联表达载体pET-SWG1-SWG2-NGF(神经生长因子β亚基)和pET-SWG1-SWG2-C7+Fc(环七肽和Fc融合蛋白)，并通过优化表达条件实现了融合蛋白SWG1-SWG2-NGF和SWG1-SWG2-C7+Fc在大肠杆菌中高效可溶性表达。伴侣蛋白和目的蛋白之间凝血酶位点酶切和再次分离纯化后，获得了具有较高生物活性的目的蛋白NGFβ亚基和G+Fc。 通过本课题研究，构建了高效可溶性表达载体，实现NGFβ亚基和G+Fc在原核高效可溶表达并具有良好生物活性。这为实现其它细胞因子或多肽类药物利用原核表达提供了模式。也为探讨原核生物的表达机制提供参考。

目录

缩略语

摘要

前言

1.1pET-SWG1-SWG2-NGF融合表达载体的构建

1.1.1实验材料

1.1.2实验方法

1.1.3实验结果

1.2.1实验材料和试剂

1.2.2实验方法

1.2.3实验结果

1.3重组蛋白NGFβ亚基活性测定

1.3.1实验材料和试剂

1.3.2实验方法

1.3.3实验结果

1.4讨论

2.1 pET-SWG1-SWG2-C7+Fc融合表达载体的构建

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.1.3实验结果

2.2.1实验材料和仪器

2.2.2实验方法

2.2.3实验结果

2.3重组蛋白C7+Fc活性鉴定

2.3.1实验材料和试剂

2.3.2实验方法

2.3.3重组蛋白G7+Fc活性测定实验结果

2.4讨论

总结

参考文献

致谢

综述RNA伴侣分子的研究进展