胆碱能系统负载在小鼠学习与记忆功能障碍中的作用

摘要

阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease，AD)是一种以认知障碍和记忆力损害为特征的中枢神经进行性退行性疾病。中枢胆碱能系统与学习记忆等密切相关。AD患者胆碱能神经细胞明显丢失，胆碱能神经纤维发生退变，导致中枢胆碱能系统功能紊乱，皮层、基底前脑的胆碱乙酰化转移酶(acetylCoA：choline-O-acetyltransferase，EC2.3.1.6；ChAT)表达减少，并以海马最为明显，乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)的生成和释放量降低。ACh是脑中与学习记忆等智能状态相关的重要分子，由ChAT合成，胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)水解，通过ACh受体发挥生物学作用。ACh水平降低是引起AD患者学习记忆等认知功能障碍的直接原因。从源头上补充胆碱能神经递质ACh的合成酶ChAT，应能增强胆碱能神经功能，提高学习记忆能力。本研究独具创意，为国内外首次提出。 然而，ChAT是一分子量69kDa的蛋白质，难以通过血脑屏障和细胞膜。我们采用新近发展起来的蛋白质转导技术，将HIV-1反式激活蛋白(trans-activatortranscription,TAT)中的蛋白转导区(proteintransductiondomain，PTD)与ChAT经基因重组进行连接，通过基因工程技术得到PTD-ChAT融合蛋白。实验结果证明重组的PTD-ChAT静脉注射给小鼠后能穿越血脑屏障，在中枢提高大脑皮层中ChAT的活性，催化ACh的生成。采用聚集态β-淀粉样肽(β-amyloidpeptide，Aβ)所致AD动物模型和自然衰老认知障碍小鼠模型，观察PTD-ChAT静脉注射后是否能够提高学习记忆能力，改善痴呆症状。结果显示在主动逃避实验中，治疗小鼠犯错误的次数明显减少，记忆时间明显延长。水迷宫实验中，治疗小鼠游泳时间明显缩短，空间辨别能力明显提高。 将PTD与异源蛋白质血蓝蛋白(TachypleusTridentatusHemocyanin，TTH)或同源蛋白质小鼠大脑蛋白粗提物(mousebrainextract，MBE)分别通过碳二亚胺偶连，腹腔和皮下注射免疫小鼠。实验结果显示PTD-MBE注射组小鼠血中无明显特异性抗体出现(P/N值小于2)，而PTD-TTH虽可引发抗体产生，但免疫原性很低，抗体滴度仅为250。

目录

前言

第一章PTD-ChAT载体构建与蛋白表达

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

1.pGEX-PTD-ChAT质粒的构建流程

2.pGEX-PTD-ChAT质粒的PCR扩增和酶切鉴定

3.基因测序图谱片段

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

5.PTD-ChAT融合蛋白的Western blotting

四、讨论

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

1.PTD-ChAT或ChAT静脉注射后对脑内ChAT活性和ACh含量的动力学研究

2.PTD-ChAT静脉注射后在体内的分布

3.AD模型的制作

4.学习记忆能力测试

四、讨论

第三章PTD-ChAT对自然衰老认知障碍小鼠学习记忆障碍的治疗作用

一、材料与方法

二、实验结果

1.衰老模型

2.免疫组化

3.生化指标测定

4.PTD-ChAT对老年痴呆模型小鼠学习记忆的影响

三、讨论

第四章PTD融合蛋白的免疫原性分析

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

1.检测抗原工作浓度的选择

3.抗体效价的测定

四、讨论

结论

致谢

参考文献

附录一:英文缩写

附录二:在学期间撰写的文章

附录三:文献综述蛋白质药物的入脑转运

核定位信号介导的细胞转运及其机制

蛋白质转导及其内在化机制