炭疽抗原的免疫机制及其蛋白质组分的二维电泳分析

摘要

炭疽芽孢杆菌芽孢是重要生物恐怖战剂之一，现人用炭疽疫苗有两种，即炭疽减毒活芽孢苗和炭疽弱毒株无菌培养滤液佐剂吸附苗(AVA)。考虑到毒力恢复的潜在危险减毒活芽孢苗仅俄罗斯(前苏联)和我国使用；AVA苗存存疫苗组分不清、对吸入性炭疽保护率较低，接种次数多，成分复杂，副反应较人，美军中使用出现拒绝接种事件等问题，AVA面临急待改进的迫切局面。庄汉澜小组在上世纪70年代也研制出保护效果良好的无菌培养滤液铝胶吸附苗(AVA)，人体接种安全、反应轻微，由于条件所限，未能作组分鉴定。为分析炭疽抗原的蛋白构成，探讨炭疽抗原的免疫机制，为疫苗改进和开发提供理论和实验依据进行了如下工作，获得初步结果。 首先建立了制备炭疽杆菌A16R株炭疽保护性抗原的适用的实验条件：培养基处方为：酸水解酪蛋白4g/L，酵母粉1g/L0．06MCael22．5ml，0．02MMgS042．5ml，0．03M磷酸钾缓冲液40ml，蒸馏水补足至1000ml，分装5瓶(200ml／瓶)。115℃20分钟高压灭菌，临种菌前分别无菌加入0．05MFeS04、0．0006MMnS04各2ml，20％葡萄糖lml，混匀后，加入5ml15％NaHC03／瓶，用1NHCl调PH至7．8-8．0，接种活化2代种子液，菌量3×107／瓶；37~C200rpm振摇培养。观察了培养液的PH值、残糖量与炭疽抗原含量间的变化规律，找到了以培养液PH值改变曲线作为检测培养液中炭疽抗原消长的指标，于培育后9小时和16小时中止培养，0．2μm过滤除菌，收集滤液、浓缩即为炭疽抗原。共制备4批炭疽抗原，供后续免疫机制和蛋白质组学分析研究。炭疽抗原经A1(OH)3吸附即为AVA。用培育9小时的炭疽抗原制成的AVA免疫小鼠，对炭疽杆菌Vollum株10LD50攻击的保护率为80％-100％。 用ELISA方法比较了三种炭疽抗原免疫小鼠特异性抗体形成的规律。对本身抗原的抗体形成规律与一般抗体形成的规律相一致，但不同免疫组小鼠对非本身抗原的抗体形成则有所不同。在芽孢苗和AVA免疫组小鼠血清中检测到抗三种抗原(灭活芽孢、9小时炭疽抗原、rPA)的IgG抗体，rPA免疫组血清中仅检测到抗rPA抗体；抗体亚型以IgGl最高，IgG2b居中，IgG2a最低；抗rPA抗体未检测到IgG2a；三组IgG抗体中皆未检测到IgG2c和IgG3。提示，制备的炭疽抗原中含少量PA，芽孢和AVA免疫不仅产生特异性体液免疫，也刺激产生细胞免疫。 用ELISPOT方法检测的AVA免疫小鼠脾细胞中对炭疽抗原的IL-4和IFN-γ分泌细胞数高达300／2×lO5和226／2×105，明显高于Al(0H)3对照组。提示AVA可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答，这与ELISA抗体检测结果相符。支持除PA外有其它成分参与抗炭疽免疫的论点。 为了解炭疽抗原的蛋白组成，通过二维电泳比较了9小时、16小时培育炭疽抗原的蛋白分布，9小时炭疽抗原蛋白点清晰、分布均匀，分子量介于14～90KD之间；16小时蛋白点主要集中于40KD以下。运用免疫蛋白质组学手段，从9小时炭疽抗原的二维电泳凝胶中共选择73个点，从炭疽杆菌数据库中鉴定出66个。其中43个点与抗体结合，23个为高丰度蛋白，不与抗体结合。与抗体结合的43个点中，13个代表PA分子，说明制备的炭疽抗原中含有PA成分，是AVA苗的重要组分。余下的有炭疽表面蛋白gAl、Sap，胶原黏附蛋白、伴侣分子DnaK等可能都是炭疽抗原中参与诱发机体免疫应答的组分。目前，这些分子在抗炭疽免疫中起什么作用，可考虑是今后免疫防御研究的主攻方向。

目录

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前言

第一部分炭疽杆菌A16R株无菌培养滤液的制备

第二部分炭疽抗原免疫机制的研究

第三部分炭疽抗原蛋白质组分的二维电泳分析

小结

参考文献

综述炭疽杆菌致辞病机制与疫苗研制策略

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博士期间发表的论文

致谢