1.趋化因子及其受体在结核杆菌感染巨噬细胞中的基因表达谱变化;2.大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒的构建

摘要

结核分支杆菌是已经发现的最为重要的传染性病原体,每年可以引起2-3百万人感染结核病.结核分支杆菌是典型的胞内致病菌,它可以在宿主巨噬细胞内存活.巨噬细胞和结核分支杆菌的初始相互作用中免疫调节因子(包括细胞因子、趋化因子及其它们的受体),在细菌能否引起机体发病中可能起着关键作用.目前,对于结核杆菌感染中趋化因子和趋化因子受体的了解十分有限.为了弄清楚趋化因子和趋化因子受体在结核杆菌感染的巨噬细胞中的变化,我们利用活化的人巨噬细胞系U937作为结核杆菌感染的体外模型,应用基因芯片检测技术、半定量PCR、流式细胞术等手段来研究巨噬细胞在不同感染阶段(6小时,12小时和24小时)的趋化因子和趋化因子受体的表达谱.基因芯片的结果显示,结核分支杆菌H37Rv感染巨噬细胞6小时和12小时都可以检测到有变化的基因,感染24小时,有明显上调的基因有25条,其中显著上调的基因有22条.在所有被检测的77条基因中,只有D6 homolog的基因是显著下调的.半定量RT-PCR证实了部分基因(IL-8,MIP1-α,RANTES,CXCR4和CCR5)的芯片检测结果.流式细胞术的结果显示H37Rv的感染可以引起U937共表达趋化因子受体CCR5和CXCR4.此外,为了获得更为有效的TB疫苗,我们利用GFP作为报告基因,分支杆菌HSP70的启动子作为在分支杆菌中调控外源基因表达的启动子构建了并初步在耻垢分支杆菌和BCG中得到了表达.总之,本研究建立了相对简单、易于获得、用于研究巨噬细胞和H37Rv相互作用的体外模型.趋化因子和受体基因表达谱显示,H37Rv感染巨噬细胞可以引起25条基因表达的明显上调和一条基因表达的显著下调.H37Rv还可以引起U937共表达趋化因子受体CXCR4和CCR5,为今后的蛋白药物靶点设计和传染病防治打下了基础.除此之外,大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒pOLYG-2的成功构建也为研制新型重组BCG打下良好基础.

目录

摘要

Abstract

第一章结核病的现状及其研究概况

第一节结核病离我们仍很近

第二节宿主抗结核免疫

一结核杆菌与感染的宿主反应与其生物学过程

二结核杆菌与巨噬细胞的相互作用

三结核杆菌感染巨噬细胞初期的免疫信号分子

第三节结核疫苗的研究

第四节、本文工作简介

参考文献

第二章结核杆菌感染巨噬细胞模型的建立

第一节引言

第二节材料和方法

一、结核分支杆菌H37Rv的培养

二、人巨噬细胞系U937细胞的培养和活化

三、流式细胞术检测巨噬细胞表面CXCR4和CCR5的表达

四、结核分支杆菌攻击巨噬细胞

第三节实验结果

一、PMA对人巨噬细胞系U937的刺激作用

二、活化前后U937表面CXCR4和CCR5的表达

三、PMA刺激前后的U937细胞对结核杆菌的吞噬作用

第四节讨论

参考文献

第三章结核杆菌感染巨噬细胞前后趋化因子及其受体基因表达谱的变化

第一节引言

第二节材料和方法

一、结核分支杆菌攻击活化巨噬细胞

二、基因芯片检测不同感染阶段U937的趋化因子和受体的基因表达谱

三、流式细胞术检测CCR5和CXCR4在不同感染阶段U937上的表达

四、半定量RT-PCR检测部分趋化因子及其受体的表达

五、统计学分析

第三节实验结果

一、巨噬细胞在不同感染阶段的趋化因子及其受体的基因表达谱

二、CCR5和CXCR4在不同感染阶段的巨噬细胞表面的表达

三、半定量RT-PCR分析部分趋化因子和受体在不同感染阶段巨噬细胞的变化

第四节讨论

参考文献

第四章大肠杆菌—分支杆菌穿梭质粒的构建

第一节引言

第二节材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

第三节实验结果

一、PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测结果

二、重组质粒pUC18b的PCR鉴定和重组质粒pUC18c的酶切鉴定

三、重组质粒pOLYG-2测序结果

四、大肠杆菌—分支杆菌穿梭质粒在耻垢分支杆菌中的表达

第四节讨论

参考文献

总结

致谢

博士后期间发表的学术论文、专著

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