两种新的方法检测散发性卵巢癌基因突变方法的应用

摘要

目的:两种最近发展的检测基因突变的方法,即变性高效液相色谱仪(DHPLC)和荧光双脱氧指纹印迹法(f-ddF)检测异质性的肿瘤标本.方法:为了比较这两种技术,我们选择了50例散发性卵巢癌的标本,其中18例有p53基因外显子5-8的突变,突变结果通过测序证实,进行了DHPLC和f-ddF的检测,f-ddF在A.L.F.Express DNA测序仪上进行,其引物使用Cy5标记,使用ddGTP和ddTTP进行单链序列分析,DHPLC使用美国Transgenomic公司的WAVE系统.结果:18例突变都可以使用DHPLC的方法发现(敏感性:100﹪),没有假阳性和假阴性,而有4例不能被f-ddF发现(敏感性:78﹪).F-ddF的结果分析比较困难,而且容易产生假阳性结果.就肿瘤的异质性而言(未知的突变型/野生型DNA比率),即使突变性DNA被野生性DNA稀释,DHPLC仍然能发现突变,说明这一方法的高度敏感性,即使只有5﹪的突变DNA或者不论有或者无LOH(等位基因丢失),DHPLC仍能发现异常,但是测序证实这一异常比较困难.总结:对于异质性肿瘤而言,DHPLC检测突变无异是最可靠的,f-ddF的敏感性和特异性都较低,但是DHPLC使用费用昂贵,而f-ddF不需要其它特殊的仪器.

目录

文摘

英文文摘

1.引言

2.材料与方法

2.1DNA提取

2.2PCR扩增

2.2.1PCR扩增方法

2.2.2p53外显子5、6、7、8PCR扩增

2.2.3用于DHPLC的p53基因突变分析PCR扩增

2.2.4用于f-ddF的p53基因突变分析PCR反应

2.2.5用于p53序列测定的PCR反应

2.3凝胶电泳

2.4DHPLC层析

3结果

3.1DHPLC

3.1.1DHPLC分离DNA分子的原理

3.1.2PCR的建立

3.1.3缓冲液梯度的建立

3.1.4层析温度的设定

3.2散发性卵巢癌肿瘤抑制基因的突变检测

3.3DHPLC结果

3.4DHPLC阳性通过直接测序证实

3.5f-ddF

3.5.1PCR建立

3.5.2结果

3.6DHPLC和f-ddF检测50例散发性卵巢癌结果的比较

4讨论

4.1DHPLC在筛检肿瘤基因突变中的效率

4.2DHPLC与DNA测序的比较

4.3影响DHPLC筛检突变灵敏度的因素

4.4肿瘤异质性对突变分析的影响

4.5DHPLC和f-ddF方法的比较

5小结

6参考文献

致谢