I钾电流与低钾诱导大鼠小脑颗粒细胞凋亡的关系研究

摘要

细胞凋亡，即细胞程序性死亡，是多细胞生物组织正常发育与正常生理功能的关键环节。不正常的细胞死亡调节可以导致癌症、高血压、心脏病、病毒感染、自身免疫、以及神经退行性疾病等多种疾病。细胞内钾浓度改变对凋亡过程的发生、发展具有很大影响。大量研究表明，凡有Caspases激活和DNA片断化发生的凋亡过程，在凋亡早期大都伴随有钾离子外流的增加和细胞内钾离子浓度的降低。在众多种特性不同的钾通道中，由于延迟整流钾电流(IK)具有较高的钾离子电导、无失活或失活缓慢等特性，被认为在凋亡早期钾外流增大过程中起着最重要的作用，但目前对这种通道在引发凋亡发生过程中作用的具体方式和被调控机制还知之甚少。为了阐明凋亡过程与IK型钾通道之间相互作用的机制以及可能涉及的亚单位和被调控方式，我们利用电生理、分子生化等实验手段在生理钾浓度(低钾)诱导大鼠小脑颗粒细胞发生凋亡的细胞模型上做了进一步的研究。 应用膜片钳全细胞电流技术，我们首先观测到将培养在含25mM高浓度钾的培养液的颗粒细胞放置于仅含5mM的低钾培养液6小时后，细胞膜IK型钾电流的幅度显著增大，其激活动力学特性也发生明显的改变。同时RT-PCR检测表明IK型钾通道主要组成成分Kv2.1亚单位的mRNA水平在低钾诱导后有明显上调，相应的细胞膜上Kv2.1蛋白量也随时间变化而升高。随后，细胞存活率下降、DNA片段化发生等细胞凋亡现象出现。使用IK型钾通道阻断剂TEA可以抑制IK型钾电流的幅度，并保护细胞抑制低钾诱导凋亡的发生。运用RNA干扰法选择性降低Kv2.1mRNA表达水平后，IK型钾电流的幅度明显被抑制，同时提高颗粒细胞的存活率。反之，过量表达Kv2.1蛋白能够导致颗粒细胞凋亡的发生。以上结果表明，在低钾诱导的颗粒细胞凋亡发生过程中，IK型钾通道开放导致钾电流外流增加是重要诱因。 本实验室以前的实验结果显示，褪黑素可以通过不同的受体亚型双向调节大鼠小脑颗粒细胞上IK通道。我们利用褪黑素受体激动剂2-iodomelatonin可以抑制IK型钾电流的特点，观测了2-iodomelatonin对低钾诱导的细胞凋亡是否有影响。实验结果表明，2-iodomelatonin可以明显地抑制颗粒细胞IK型钾电流的幅度，并改变其动力学特征；同时，2-iodomelatonin能够提高细胞在低钾诱导凋亡后的存活率，并且抑制导致细胞凋亡发生的关键酶Caspase-3的活性。由于2-iodomelatonin不具有褪黑素的细胞抗氧化作用，而且2-iodomelatonin对细胞的保护作用和对Caspase-3活性的抑制作用都能够被褪黑素受体拮抗剂4P-PDOT阻断，提示2-iodomelatonin的细胞保护作用是通过激活褪黑素受体，然后抑制IK型钾通道这一途径而实现，而不是通常认为的褪黑素的抗氧化效应。 细胞PKA和PKC信号通路在细胞凋亡发生、发展中起到关键作用，但是否与细胞膜离子通道有关很少报道，我们对此进行了研究。电流记录结果显示，瞬时给与腺苷酸环化酶激动剂forskolin明显抑制颗粒细胞上IK型钾电流的幅度，并改变其动力学特征，forskolin的IK抑制作用可以被PKA抑制剂H-89所阻断；forskolin孵育也明显降低Kv2.1mRNA表达水平，改变IK型钾电流的动力学特征。与电流结果一致的是，forskolin明显提高颗粒细胞在低钾诱导凋亡下的细胞存活率，抑制DNA片断化的发生。Forskolin这一细胞保护作用可以被H-89所阻断。利用RNA干扰法减少Kv2.1mRNA水平能够降低forskolin对IK型钾电流的抑制作用，同时可以降低forskolin对颗粒细胞在低钾诱导凋亡下的保护作用。上述实验结果表明，IK型钾通道，尤其是Kv2.1亚单位，是PKA信号通路保护细胞途径的重要下游分子。 最新研究表明，细胞膜脂质成分的改变可以影响离子通道在细胞膜上的分布和电压门控特性。我们还观测了胆固醇对颗粒细胞IK型钾通道的影响以及凋亡过程的作用。实验结果显示，改变质膜上胆固醇的浓度可以影响IK型钾电流的幅度、动力学特征以及通道蛋白在膜上的分布状态，同时影响颗粒细胞对低钾诱导凋亡的敏感性。初步的实验结果表明了胆固醇对细胞凋亡的作用也可能与IK型钾电流的被调节有关。这一作用的内在联系和具体机制将在后续研究中继续探索。

目录

摘要

前言

材料与方法

第一章、低钾诱导颗粒细胞凋亡过程与IK型钾电流

第二章、褪黑素受体介导IK型钾电流调节与细胞凋亡过程

第三章、PKA信号通路调节IK钾通道保护细胞对抗细胞凋亡

第四章、膜脂质调节IK钾通道特性并影响细胞凋亡进程

总结与展望

综述

参考文献

论文发表情况

致谢