胞外DNA在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用及其释放机制的研究

摘要

表皮葡萄球菌是一种机会致病菌，近年来已作为重要的院内感染致病菌之一引起广泛重视，其主要致病力是形成生物膜(biofilm,BF)的能力。所形成的生物膜中超过90﹪的成份为胞外多聚物基质(extracellularpolymericsubstancematrix，EPS)，胞外多聚物基质主要由一些胞外多糖，蛋白质，DNA以及一些其它的大分子组成。目前胞外DNA在细菌生物膜形成中的作用在很多细菌中都有报导，但在表皮葡萄球菌中生物膜中的作用未见相关研究。本论文旨在探讨胞外DNA在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用及其释放机制。 一．胞外DNA在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用 为了研究胞外DNA对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响，我们使用DNA酶(DNaseI)对表皮葡萄球菌生物膜阳性菌株RP62A和1457株进行了研究。结果显示在细菌培养后0、2、4h时加入DNaseI能够抑制生物膜的形成，6h加入时则部分抑制生物膜的形成，而对成熟生物膜(12h)则无明显的影响。 进而我们研究了DNaseI对表皮葡萄球菌起始黏附的影响，在表皮葡萄球菌1457菌株PBS悬液加X6孔板时加2XDNaseI(终浓度2mg/mD处理，未经DNaseI处理作为对照。经DNaseI处理的菌悬液只有很少的细菌(1.2×103个细菌/cm2)黏附在培养板(聚苯乙烯，Polystyrene)的表面。未经DNaseI处理的菌悬液黏附在培养板表面的细菌数为25．8×lO3个细菌/cm2，是DNaseI处理过的菌的24倍。 为了解表皮葡萄球菌胞外DNA的释放情况，用紫外分光光度计检测DNA(A260)的方法检测了表皮葡萄球菌1457菌株在对数生长早、中、晚期(2h、4h、6h)胞外DNA的释放量。结果显示胞外DNA的释放量以对数生长早期为最高(10.92+0．40ug／m1)，中期下降(8．12～0．46ug／m1)，而对数生长晚期又略有上升(9.54+0．43ug／m1)，提示胞外DNA与基因组DNA是相似的。 为了了解胞外DNA是否来源于染色体DNA，我们根据NCBI公布的表皮葡萄球菌RP62A菌株的全基因组序列，选择了平均位于细菌染色体DNA上的五个基因：yycF,trpS,srrA，sigmaB和isaA，设计引物，分别以表皮葡萄球菌t457株基因组DNA和培养上清胞外DNA为模板行PCR，结果显示基因组DNA与胞外DNA均能扩增出相同片断。 二．表皮葡萄球菌胞外DNA释放机制的研究 AtlE(autolysinE)蛋白在表皮葡萄球菌生物膜形成的起始黏附阶段起作用，为了解表皮葡萄球菌atlE基因在不同时点的转录水平，采用RT-PCR法检测了表皮葡萄球菌1457atlE基因在对数生长早、中、晚期(2h、4h、6h)的表达水平。发现atlE基因在对数生长早期其转录水平最高，中期最低，这与胞外DNA在对数生长期的释放情况是一致的，说明胞外DNA的量与atlE的表达具有相关性。 为了解表皮葡萄球菌atlE基因与胞外DNA释放的关系，采用pBT2质粒同源重组敲除的方法构建了表皮葡萄球菌1457的atlE基因敲除突变株，并对SEl457野生株和AatlE株的生物膜形成能力及起始黏附力进行了研究。结果发现，突变株丧失了形成生物膜形成能力(野生株A5701.05，突变株A5～0．092)，其在多聚物表面的起始黏附能力也明显下降，野生株黏附在多聚物表面的细菌数(31.2×103个细菌/cm2)是突变株黏附细菌数(0．8×103个细菌／em2)的40倍。 我们用PicoGreen与紫外分光光度法分别检测了1457野生株和AatlE株浮游培养与起始黏附期的胞外DNA量，结果都表明在浮游培养与起始黏附中突变株与野生株比较DNA的释放量均明显下降。为了更好的反映不同培养环境下胞外DNA的释放情况，采用荧光染液碘化丙啶(PI)对在96孔板中静置培养的1457野生株和AatlE株细菌进行染色，PI染液不能透过细胞膜，只染细胞外DNA，所染色的DNA应为生物膜及悬浮于培养基中的DNA，结果显示AatlE株胞外DNA量与野生株比较明显减少；又用另一种荧光染液DDAO对流动装置flow-chamber中形成的生物膜中的DNA进行染色，结果也显示△atlE株生物膜中胞外DNA量与野生株比较明显降低。 Agr为群体感应系统，agr突变会导致AtlE蛋白表达增加。我们用RT-PCR的方法检测了细菌生长平台期(24h)1457野生株与D～agr株atlE基因的表达水平，发现Aagr株atlE基因的表达水平与1457野生株未见明显差异，同时也检测了Aagr株微量板培养及生物膜中胞外DNA的释放，发现其胞外DNA的量高于1457野生株。 我们用RT-PCR的方法检测了对数生长中期(4h)icaA，icaR及sigB三个与生物膜形成相关的基因的转录水平，结果发现与野生株比较，AatlE株的icaA转录下调，icaA负调控子icaR转录上调，而负调控icaR的sigB转录下调。 综上所述，通过DNA酶能够降低表皮葡萄球菌起始黏附从而抑制生物膜的形成，证实了胞外DNA是表皮葡萄球菌生物膜形成所必需的。通过构建表皮葡萄球菌atlE基因敲除突变株，表明atlE基因能影响胞外DNA的释放，用表皮葡萄球菌1457Aagr株表明agr系统可能通过调控atlE基因参与胞外DNA的释放。

目录

论文独创性声明及论文使用授权声明

前言

第一部分胞外DNA在表皮葡萄球菌生物膜形成中的作用

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分表皮葡萄球菌胞外DNA释放机制的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

论文总结

参考文献

综述 细菌生物膜中群体感应与DNA的释放

附录

致谢