阻断间接识别途径抑制同种异体移植慢性排异的实验研究

摘要

目的： 1．建立体外培养、扩增受体C3H小鼠骨髓源性树突状细胞(BM-DC)的方法，并对其进行鉴定；观察其对供体C57BL/6小鼠可溶性抗原提呈的有效性。同时探讨B7反义肽(B7 antiserlse peptide，B7AP)抑制单向混合淋巴细胞反应的作用，并明确B7AP显著抑制单向混合淋巴细胞反应的最适工作浓度。 2．通过体外供体抗原间接识别反应体系，观察B7AP预处理的负载供体抗原的受体树突状细胞(dendritic cell，DC)诱导针对供体抗原的特异性免疫低反应；同时通过体内实验进一步观察其可行性，并对其机制进行初步分析。 3．建立同种异基因小鼠颈总动脉原位移植模型(C57BL/6→C3H)，观察阻断间接识别途径对移植动脉慢性排异的影响，并初步探讨此种效应的局部机制。 方法： 1．体外分离受体C3H小鼠骨髓细胞，在重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF) 和肿瘤坏死因子-α(rmTNF-α)的刺激下，手法筛选、培养扩增受体小鼠骨髓源性树突状细胞；通过细胞形态、功能、表面分子表达对其进行鉴定。在培养过程中加入制备的供体C57BL/6小鼠可溶性抗原，通过与受体C3H小鼠脾脏T细胞进行单向混合淋巴细胞反应，观察受体DC负载供体抗原的有效性。进一步利用不同浓度的B7AP与负载供体抗原的受体DC进行充分孵育，并与受体脾脏T细胞进行单向混合淋巴细胞反应(MLR)，建立B7AP浓度对数值与单向混合淋巴细胞反应cpm值(每分钟液闪数)的曲线，应用统计学方法寻找B7AP显著抑制单向混合淋巴细胞反应的最适工作浓度。 2．建立体外供体抗原间接识别反应体系，利用B7AP预处理的负载供体抗原的受体DC与受体T细胞行初次单向混合淋巴细胞反应，收集反应后受体T细胞，与负载供体抗原、第三供体抗原的受体DC和供体DC行再次单向混合淋巴细胞反应，观察反应后受体T细胞针对间接途径提呈的供体抗原、第三供体抗原以及直接途径提呈的供体抗原的免疫活性。同时通过B7AP封闭的负载供体抗原的受体DC对受体小鼠进行预处理后，分离受体脾脏T细胞与负载供体抗原、第三供体抗原的受体DC和供体DC行再次单向混合淋巴细胞反应，了解B7AP封闭的负载供体抗原的受体DC体内有效性，并分别在早期和2月时对受体小鼠进行供体抗原刺激后取脾脏进行细胞因子和淋巴细胞凋亡(apoptosis)分析，初步探讨免疫耐受的其他可能机制。 3．建立小鼠同种异基因颈总动脉原位移植模型(C57BL/6→C3H)，通过术前3 天对受体小鼠进行股静脉注射B7AP预处理的负载供体抗原的受体DC，2月后取移植动脉进行病理分析，观察移植动脉内膜增生情况，作计算机图像分析，并通过对移植动脉的免疫组化分析，初步了解此效应的局部机制。 结论： 1.C3H小鼠骨髓前体细胞在rmGM-CSF 和TNF-α的刺激下，可以扩增培养大量成熟 DC。 2.受体C3H小鼠的成熟DC能够有效的提呈供体C57BL/6小鼠可溶性抗原。 3.负载供体抗原的受体C3H小鼠DC经B7AP预处理后能够抑制其和受体小鼠T 细胞的单向混合淋巴细胞反应。 4.B7AP预处理的负载供体抗原的受体DC能够诱导针对供体抗原的特异性免疫低反应，同时可能通过诱导Th1→Th2免疫偏移来加强这种效应。 5.断间接途径产生的受体T细胞的特异性免疫低反应不影响其对直接途径提呈的供体抗原的免疫反应。 6. B7AP预处理的负载供体抗原的受体DC能够有效抑制小鼠同种异基因颈总动脉原位移植(C57BL/6→C3H)后移植动脉的内膜增生，TGF-β1在局部可能发挥一定的作用。 7.B7AP 阻断间接识别途径能够有效抑制同种异体移植慢性排异反应。

目录

声明

前言

第一部分负载供体抗原的受体小鼠骨髓源性树突状细胞体外培养及B7反义肽对其免疫功能的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分B7反义肽预处理的负载供体抗原的受体树突状细胞诱导供体特异性的免疫低反应

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分B7反义肽预处理的负载供体抗原的受体树突状细胞抑制移植动脉的内膜增生

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

总结

附录

致谢