结核分枝杆菌利福平耐药相关基因突变检测及Rv2629基因191A/C突变功能初步研究

摘要

结核病是人类世界古老的细菌性传染病。目前，全世界60亿人口中，近1/3(约18亿)感染结核分枝杆菌。根据WHO统计，每年新发病人达800～1000万，每年因结核病死亡者达200余万，98％的结核病死亡发生在发展中国家。作为有着巨大人口压力的发展中国家，中国的结核病负担也相当严重。 近三十年来，结核分枝杆菌与HIV的共感染，以及多耐药结核分枝杆菌的出现改变了结核的流行病学模式，尤其是近期在非洲大陆发现极端耐药结核分枝杆菌，该类病原菌耐受包括利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和链霉素等在内的所有一线药，并表现出对6种二线治疗药物中的至少3种耐药。到目前为止，极端耐药性结核分枝杆菌已在全球包括8个欧洲国家在内的28个国家传播，而极端耐药性结核患者数量约为2.7万例，因此而死亡的患者数已逾1.6万例。这些数据使得全部极端耐药性结核感染患者的死亡率超过了50％，甚至在某种程度上高过了艾滋病感染的致死率。另据一项调查表明，艾滋病患者更容易受到“极端耐药结核菌”的感染而死亡。目前所有可用的抗结核药物都无法治疗这种结核病，一旦传播开来，人类将面临重大灾难。研究结核分枝杆菌的耐药机制，对开发新型药靶，研制快速、简便的检测方法意义重大。 利福平是治疗结核病的重要一线药物，超过95％的利福平抗性的产生是由于编码RNA聚合酶β-亚单位基因中(rpoB)81对碱基突变造成，但3％～10％的利福平耐药菌株的rpoB基因未检测到突变，说明结核分枝杆菌存在其它的利福平抗性机制。90％以上耐利福平菌株也抗异烟肼，所以利福平抗性也是多耐药结核的一个潜在标志。 为了检测利福平耐药株中的耐药因子，我们采用蛋白质组学的技术手段，对结核分枝杆菌H37Rv和临床耐药菌株的菌体蛋白进行比较分析，对差异蛋白点进行质谱分析和数据库检索鉴定，继而对蛋白的编码基因克隆测序。一共有9个差异蛋白被鉴定出来，它们是Rv0054、Rv0927c、Rv1446c、Rv2145c、Rv2629、Rv2334、Rv3J33c、Rv3136和Rv3841。通过设计特异性引物PCR扩增18株临床利福平耐药菌株、15株药物敏感菌株和实验室标准株H37Rv的对应片段，进行DNA测序。结果显示：Rv0054、Rv3133c、Rv2145、Rv3136c和Rv2334等5个基因的核苷酸序列在所有菌株中没有发生突变。Rv0927c基因402—422位碱基的GCA缺失，导致编码的140位丝氨酸(SER)缺失；Rv1446c基因575位碱基的GMP残基突变为CMP，导致编码的氨基酸由精氨酸(ARG)突变为脯氨酸(PRO)；Rv3841基因468位碱基的AMP残基突变为GMP，但编码的156位氨基酸仍然保持为亮氨酸(LEU)。这些基因突变位点同利福平耐药的关联度不高，可能是菌株地域多态性在基因水平的显示，可以作为流行病调查时参考的分子指标。而Rv2629基因中发现了191 A/C突变，导致64ASP变为64ALA。这种突变存在于112株临床利福平耐药菌株中的111株，突变率达99.1％;然而在30株临床药物敏感菌株中未发现。进一步将Rv2629基因的野生型和突变型转入利福平敏感的耻垢分枝杆菌，药敏实验证实Rv2629基因在191位点的突变可以增强受体菌的耐药性，而野生型基因不能赋予重组菌株药物耐受性。同时对该蛋白进行了体外表达，通过质谱技术测定了野生型重组蛋白和突变蛋白的分子量分别为46268.4Da和46231.5Da。利用制备的兔源多抗血清，对该蛋白在H37Rv菌体的分布进行了亚细胞定位，Western Blot结果显示蛋白主要位于细胞膜和细胞壁。对不同菌株中基因的mRNA转录水平进行了RT—PCR分析，在利福平耐药菌株中基因的拷贝数的校正值平均数为1.68×10-2，显著高于敏感菌株的9.00×10弓和标准实验株的4.65×10.3。 实验结果初步证明Rv2629基因的191A/C突变同结核分枝杆菌的利福平耐药性高度相关。为进一步阐释结核分枝杆菌的利福平耐药机理，特别是那些RNA聚合酶β-亚单位基因未突变菌株的耐药原理提供了新的思路。也为临床开发新的检测耐药菌株的方法提供了基础。

目录

论文说明:缩略词表

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摘要

第一章结核分枝杆菌耐药分子机制

第一节结核病现状及结核分枝杆菌耐药性

第二节结核分枝杆菌耐药的分子机制

第三节结核分枝杆菌耐异烟肼分子机制

第四节结核分枝杆菌耐利福平分子机制

第五节结核分枝杆菌耐链霉素分子机制

第六节结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺分子机制

第七节结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分子机制

第八节 结核分枝杆菌耐受其它药物的分子机制

参考文献:

第二章结核分枝杆菌耐利福平相关基因突变检测

第一节实验材料与方法

第二节基因突变位点分析

第三节Rv2629基因突变分析

第四节讨论

参考文献:

第三章Rv2629基因191A/C突变功能初步研究

第一节实验材料与方法

第二节Rv2429基因功能研究

第三节讨论

参考文献:

第四章总结和展望

第一节全文总结

第二节展望

博士期间发表、撰写的学术论文

博士期间专利申请

附录

致谢