不同类型的巨噬细胞对肿瘤生长的影响及其机制

摘要

肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病。它和心血管疾病已在全世界成为死亡原因的前两位。在肿瘤组织中，含有较多的非肿瘤细胞，包括基质细胞(成纤维细胞和内皮细胞)和白细胞。巨噬细胞是浸润到肿瘤的白细胞的主要成分。肿瘤组织中的巨噬细胞，即肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage，TAM)与肿瘤的关系以及在肿瘤中发挥的多种功能正被深入的研究。肿瘤相关巨噬细胞不同的活化状态决定了其在肿瘤中是发挥抗肿瘤作用或促肿瘤作用。一方面，TAM可以通过吞噬、杀伤肿瘤细胞以及递呈肿瘤相关抗原发挥免疫监视和抗肿瘤作用；另一方面，TAM可以通过释放许多趋化因子和细胞因子促进肿瘤生长和血管生成，并且可以降解基质促进肿瘤侵袭和转移。
　　 巨噬细胞至少可以被分为两种类型：M1型，即经典活化的巨噬细胞 (Classically activated macrophage)和M2型，即替代性活化的巨噬细胞(Alternatively activated macrophage)。M1型巨噬细胞在细菌或其产物脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)或干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)的诱导下产生，表现为：高递呈抗原的能力；高分泌白细胞介素12(Interlukin-12，IL-12)和白细胞介素23(Interlukin-23，IL-23)及其随后诱导的Ⅰ型免疫应答；高产生毒性中间产物[一氧化氮(Nitric oxide，NO)，活性氧中间产物(Reactive oxygen intermediates，ROI)]的能力。因此，M1型巨噬细胞被认为具有杀伤细菌和肿瘤细胞并可以分泌多种促炎性细胞因子的能力。而M2型巨噬细胞可由白细胞介素4(Interlukin-4，IL-4)、白细胞介素13(Interlukin-13，IL-13)、糖皮质激素、转化生长因子-β(Transformating growth factor-β，TGF-β)和前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)等诱导产生，表现为：低的递呈抗原的能力；产生抑制细胞增殖和活性的细胞因子，如白细胞介素10(Interlukin-10，IL-10)；较好的清除碎片的能力；促进血管生成和创伤愈合的能力。 近几年来越来越多的研究表明TAM并未发挥抗肿瘤作用，而是参与了肿瘤的发生、生长、侵袭和转移的过程，尤其是与肿瘤的血管生成和淋巴管生成密切相关。根据巨噬细胞在肿瘤中发挥的作用及巨噬细胞的活化类型，我们推测在肿瘤中存在着这两种类型的巨噬细胞，并且肿瘤发生发展的早期，肿瘤中的巨噬细胞以M1型为主，发挥免疫监视和抗肿瘤作用，而在肿瘤的晚期，肿瘤中的巨噬细胞以M2型为主，发挥促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用；肿瘤中巨噬细胞在肿瘤早期和肿瘤晚期发生了类型的改变，从而影响肿瘤的生长、侵袭和转移。那么，肿瘤中巨噬细胞的类型在肿瘤发生发展中是否如我们所推测得这样发生类型的转换呢?不同类型的巨噬细胞如何影响肿瘤的生长?为了解决上述问题，我们使用4T1荷瘤BALB/c小鼠作为实验动物模型，观察荷瘤小鼠肿瘤早期和晚期TAM的类型变化。在此基础上我们研究不同类型的巨噬细胞对肿瘤生长的影响及其机制，以期为以TAM为靶点的肿瘤治疗提供理论基础和实验依据，对深入研究肿瘤免疫和肿瘤治疗有一定的意义。
　　 1.巨噬细胞的分型及其鉴定
　　 我们首先使用来源于Abelson小鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)诱导的肿瘤的巨噬细胞系RAW264.7细胞作为体外来源的巨噬细胞。根据已有的文献，我们选用了LPS作为了M1型巨噬细胞的诱导剂，IL-4作为M2型巨噬细胞的诱导剂，在体外诱导M1型和M2型巨噬细胞。以未处理的RAW264.7细胞作为对照，我们对在体外诱导的M1型和M2型巨噬细胞用FACS检测巨噬细胞膜分子CD16/32和CD206的表达、用RT-PCR检测巨噬细胞分泌的趋化因子CCL3(CC subtype chemokine ligand 3，巨噬细胞炎症蛋白1 α)和CCL22(CC subtype chemokine ligand 22，巨噬细胞源趋化因子)以及巨噬细胞特异性检测指标iNOS(Inducible nitric oxide synthase，诱导型一氧化氮合成酶)和Arg-1(Arginase-1，精氨酸酶-1)的表达。结果表明：LPS诱导的RAW264.7细胞与对照组相比表达较高水平的CD16/32膜分子，表达较低水平的CCL22并几乎不表达Arg-1基因；而IL-4诱导的RAW264.7细胞与对照组相比表达较高水平的CD206膜分子，表达非常高水平的Arg-1基因，而表达较低水平的CD16/32膜分子和CCL3基因。上述结果表明，我们在体外成功地用LPS诱导了M1型巨噬细胞，用IL-4诱导了M2型巨噬细胞。 我们接着观察在疾病模型中巨噬细胞的类型，通过分离乳腺癌细胞株4T1荷瘤4周的BALB/c小鼠的巨噬细胞，以密度-梯度离心及细胞贴壁所得的肿瘤巨噬细胞用FACS检测巨噬细胞膜分子CD16/32和CD206的表达、用RT-PCR检测巨噬细胞分泌的趋化因子CCL3和CCL22以及巨噬细胞特异性检测指标iNOS和Arg-1的表达，并且用酵母菌进行了吞噬功能的检测。结果表明：从第4周的4T1荷瘤小鼠分离到的肿瘤巨噬细胞表达较低水平的CD16/32膜分子和较高水平的CD206膜分子，表达较高水平的CCL22和Arg-1基因，并且对酵母菌的吞噬能力明显下降(P<0.05)。这些数据表明4周的荷瘤小鼠肿瘤组织中含有大量的M2型巨噬细胞。
　　 以上结果表明：巨噬细胞至少可以分为两种类型，我们存体外成功地用LPS诱导了M1型巨噬细胞，用IL-4诱导了M2型巨噬细胞，并且在肿瘤状态的小鼠体内检测到较多的M2型巨噬细胞。
　　 2.肿瘤发生发展过程中巨噬细胞的类型变化
　　 为了研究巨噬细胞的类型在肿瘤发生发展过程中有无改变，我们用乳腺癌细胞株4T1细胞荷瘤小鼠，作为肿瘤动物模型。我们首先通过荷瘤小鼠肿瘤生长的大小、重量、有无向周围淋巴结和远处肺组织转移，确定肿瘤发生发展过程的早期和晚期。荷瘤后第4周，荷瘤小鼠的肺组织经过Bouin’s液固定后可见有一个至多个大小不一的白色肿瘤转移灶，并且肺组织病理切片中可见到聚集成团的肿瘤转移灶。同时，在4周荷瘤小鼠的荷瘤同侧腋下淋巴结的病理切片中可见到聚集成团的肿瘤转移灶。因此，结合荷瘤小鼠肿瘤生长的大小和重量，我们确定在BALB/c小鼠荷瘤后的1周内为肿瘤早期，而在荷瘤后的3-4周为肿瘤晚期。 我们接着对早期和晚期荷瘤BALB/c小鼠肿瘤组织病理切片分别用FITC标记的F4/80单克隆抗体与PE标记的CD16/32或FITC标记的F4/80单克隆抗体与PE标记的CD206单克隆抗体进行免疫荧光染色，观察在肿瘤的早期和晚期肿瘤组织巨噬细胞的类型有无改变。结果表明，在肿瘤的早期，肿瘤组织巨噬细胞以M1型(F4/80+CD16/32+)为主，而在肿瘤的晚期，肿瘤组织巨噬细胞以M2型(F4/80+CD206+)为主。我们最后对肿瘤发生发展过程的早期和晚期与肿瘤组织巨噬细胞的类型进行相关性研究，结果表明：在肿瘤的早期，肿瘤组织巨噬细胞以M1型为主，而在肿瘤的晚期，肿瘤组织巨噬细胞以M2型为主的现象与肿瘤发生发展的进程相关。
　　 以上结果显示在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤巨噬细胞的类型发生了改变，在肿瘤的早期，肿瘤组织巨噬细胞以M1型为主，而在肿瘤的晚期，肿瘤组织巨噬细胞以M2型为主，并且肿瘤巨噬细胞类型的改变与肿瘤发生发展的进程相关。
　　 3.不同类型的巨噬细胞在肿瘤生长中的作用 为了研究不同类型的巨噬细胞对肿瘤生长有无影响，我们在体外对RAW264.7细胞用LPS诱导了M1型巨噬细胞，用IL-4诱导了M2型巨噬细胞，并以未刺激的RAW264.7细胞作为对照，与4T1细胞按1:2的比例混合后，在BALB/c小鼠的腹部皮下进行注射，使小鼠荷瘤。在小鼠荷瘤后，从第二天起每天观察荷瘤小鼠的肿瘤出现的早晚，肿瘤的大小，并且在第7天和第28天，每组荷瘤小鼠取脾细胞，检测其CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群的变化，并检测脾细胞对4T1肿瘤细胞的杀伤功能。结果表明：IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠肿瘤出现的时间略早于其它组，并且肿瘤也比其它组大；在肿瘤早期，IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞的CD4+T细胞亚群的比例为37.01％，与LPS诱导的M1型巨噬细胞组(34.50％)、未刺激的RAW264.7细胞组(36.74％)和正常小鼠(35.28％)相似，略高于4T1肿瘤细胞对照组(30.91％)，而IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞的CD8+T细胞亚群的比例为17.33％，与LPS诱导的M1型巨噬细胞组(17.15％)、未刺激的RAW264.7细胞组(17.00％)和正常小鼠(16.84％)相似，略高于4T1肿瘤细胞对照组(15.14％)；在肿瘤晚期，IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞的CD4+T细胞亚群的比例为8.16％，低于未刺激的RAW264.7细胞组(11.26％)和4T1肿瘤细胞对照组(18.19％)，远低于LPS诱导的M1型巨噬细胞组(31.41％)和正常小鼠(36.16％)，而IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞的CD8+T细胞亚群的比例为5.07％，低于未刺激的RAW264.7细胞组(5.86％)和4T1肿瘤细胞对照组(7.78％)，远低于LPS诱导的M1型巨噬细胞组(16.19％)和正常小鼠(21.30％)；在肿瘤早期，IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞对4T1肿瘤细胞的杀伤能力为45.39％，略低于LPS诱导的M1型巨噬细胞组(50.95％)，远低于未刺激的RAW264.7细胞组(75.61％)、4T1肿瘤细胞对照组(82.54％)和正常小鼠(64.29％)；而在肿瘤晚期，IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞对4T1肿瘤细胞的杀伤能力为41.75％，远低于LPS诱导的M1型巨噬细胞组(67.51％)和正常小鼠(67.76％)。
　　 以上结果显示在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤巨噬细胞的类型可以影响肿瘤的生长、荷瘤小鼠T细胞亚群和荷瘤小鼠T细胞的功能。给予荷瘤小鼠M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的生长。在肿瘤的早期，荷瘤小鼠T细胞亚群和T细胞的功能改变不明显，而在肿瘤的晚期，给予荷瘤小鼠M1型巨噬细胞可以促使荷瘤小鼠T细胞亚群和T细胞的功能恢复至正常小鼠水平，有利于抗肿瘤应等。
　　 4.不同类型的巨噬细胞影响抗肿瘤免疫的机制研究--M2对调节性T细胞的诱导作用 许多的研究表明调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。为了了解调节性T细胞在荷瘤小鼠的早期和晚期有无改变，我们分离4T1荷瘤小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞，用FACS检测CD4+CD25+Treg细胞比例和数量的改变。结果表明：CD4+CD25+Treg细胞在荷瘤小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞的比例在肿瘤晚期比肿瘤早期明显增加(7.36％vs 4.47％，P<0.05)；CD4+CD25+Treg细胞在荷瘤小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞的数量在肿瘤晚期比肿瘤早期明显增加(2×104 vs 1×103，P<0.05)。
　　 我们进而研究了不同类型的巨噬细胞对肿瘤生长的影响，在观察荷瘤小鼠CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群的变化并检测脾细胞对4T1肿瘤细胞的杀伤功能的同时我们观察了荷瘤小鼠的脾细胞中Treg细胞的变化。结果表明：在肿瘤早期，IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞CD4+Foxp3+细胞占CD4+细胞的比例为9.34％，与LPS诱导的M1型巨噬细胞组(11.04％)、未刺激的RAW264.7细胞组(10.46％)、4T1肿瘤细胞对照组(10.24％)和正常小鼠(10.87％)相似；而在肿瘤晚期，IL-4诱导的M2型巨噬细胞组小鼠脾细胞CD4+Foxp3+细胞占CD4+细胞的比例为22.43％，明显高于LPS诱导的M1型巨噬细胞组(14.31％)和正常小鼠(13.90％)，略高于未刺激的RAW264.7细胞组(20.42％)和4T1肿瘤细胞对照组(18.57％)。这些结果说明不同类型的巨噬细胞影响肿瘤生长，可能通过其诱导免疫负调控细胞-Treg抑制免疫应答而介导的。在肿瘤的早期，巨噬细胞的类型对荷瘤小鼠的Treg细胞水平影响不大，而在肿瘤的晚期，M 2型巨噬细胞可以促使荷瘤小鼠的Treg细胞水平显著提高，不利于机体的抗肿瘤免疫应答。
　　 为了观察不同类型的巨噬细胞对Treg细胞的影响，我们在体外对RAW264.7细胞用LPS诱导了M1型巨噬细胞，用IL-4诱导了M2型巨噬细胞，并以未刺激的RAW264.7细胞作为对照，与从4T1荷瘤小鼠细胞中分离的脾脏或引流淋巴结细胞混合培养48小时后，用FACS检测CD4+CD25+Treg细胞比例的改变。结果表明：IL-4诱导的M2型巨噬细胞组CD4+Foxp3+Treg细胞的比例比LPS诱导的M1型巨噬细胞组和T细胞对照组有明显的提高。并且我们检测了不同类型巨噬细胞的TGF-β的基因水平，结果表明IL-4诱导的M2型巨噬细胞组的TGF-β的基因水平明显高于LPS诱导的M1型巨噬细胞组和未刺激的RAW264.7细胞组。由于TGF-β都有助于诱导Treg细胞，因此上述结果表明不同类型的巨噬细胞可以影响Treg细胞，从而影响抗肿瘤免疫应答。
　　 综上所述，我们首先在体外成功地用LPS诱导了M1型巨噬细胞，用IL-4诱导了M2型巨噬细胞，在此基础上研究不同类型的巨噬细胞与肿瘤发生发展的关系。通过对肿瘤组织中巨噬细胞的观察表明在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤巨噬细胞的类型发生了改变，在肿瘤的早期，肿瘤组织巨噬细胞以M1型为主，而在肿瘤的晚期，肿瘤组织巨噬细胞以M2型为主，并且肿瘤巨噬细胞类型的改变与肿瘤发生发展的进程相关。我们进一步研究不同类型的巨噬细胞对肿瘤生长的影响及其机制，结果表明M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的生长并且可以诱导调节性T细胞，M1型巨噬细胞可以促使荷瘤小鼠T细胞亚群和荷瘤小鼠T细胞的功能恢复至正常小鼠水平，有利于抗肿瘤应答。因此，改变巨噬细胞类型可以影响机体对肿瘤的免疫应答。本研究为以肿瘤组织巨噬细胞为靶点的肿瘤治疗提供理论基础和实验依据，以期对深入研究肿瘤免疫和肿瘤治疗有一定的意义。