血管生成素样蛋白3调节人肾小球内皮细胞通透性的研究

摘要

目前，越来越多的研究证实肾小球足细胞分泌的一些分子能影响肾小球内皮细胞的结构和功能，导致。肾小球内皮细胞滤过功能的改变而参与蛋白尿的发生和发展，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素1(angiopoietin1，Ang1)。本课题组曾应用基因芯片技术发现微小病变肾病综合征患儿的血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like protein3，Angptl3)mRNA的表达水平显著高于正常儿童，及应用激光微切割技术分离肾组织发现在阿霉素大鼠肾病模型的肾小球内Angptl3 mRNA和蛋白的表达随着蛋白尿的加重而表达增高，并运用Western免疫印迹和实时荧光定量PCR技术发现体外培养的足细胞表达Angptl3，进一步还发现在微小病变和膜性肾病肾小球内Angptl3显著高于正常对照、薄基底膜肾病及局灶节段性肾小球硬化。以上实验结果显示Angptl3在肾小球内由足细胞分泌，并可能参与了蛋白尿的发生和发展。
　　 血管生成素样蛋白是与血管生成素结构相似的糖蛋白，其含有N端的卷曲螺旋结构和C段的纤维蛋白原同源区域。研究发现Angptl3能与脐静脉内皮细胞整合素αvβ3纤维蛋白原同源区域结合，而其它研究已发现整合素αvβ3也是肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cells，GEnCs)表达的整合素异构体之一。因此，我们推测在肾小球由足细胞分泌Angptl3可能通过与肾小球内皮细胞表面整合素αvβ3结合调节肾小球内皮细胞的通透性参与了蛋白尿的发生和发展。为此我们进行了以下三部分的研究，以探讨Angptl3是否能调节肾小球内皮细胞的通透性并研究其作用的可能机制。
　　 第一部分肾小球内皮细胞培养和单层膜的建立
　　 目的：观察肾小球内皮细胞在微孔细胞培养嵌套的滤膜上是否能形成生成致密连接的单层膜。
　　 方法：以3-8代的GEnCs密度为1×105/cm2接种于微孔细胞嵌套滤膜上。对滤膜肾小球内皮细胞行考马斯亮兰染色和定期测定滤膜肾小球内皮细胞电阻以确定GEnCs是否形成致密连接的单层膜。
　　 结果：考马斯亮兰染色见GEnCs单层膜呈现为蓝色的片状，细胞间无间隙，表明GEnCs汇合成致密的单层。形成致密融合状态的肾小球内皮细胞单层膜电阻为(30.45±1.52)Ω/cm2。
　　 结论：在微孔细胞嵌套滤膜上生长的肾小球内皮细胞能形成致密的单层膜。
　　 第二部分血管生成素样蛋白3调节肾小球内皮细胞通透性
　　 目的：探讨血管生成素样蛋白3对肾小球内皮细胞通透性的影响。方法：肾小球内皮细胞接种于微孔细胞培养嵌套的滤膜上，待细胞形成致密的单层膜后，分别给予不同浓度的Angptl3(0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.51μg/ml)作用1h；用浓度为0.5μg/ml Angptl3分别作用于GEnCs1h、2h、3h。采用Millicell-ERS和两室弥散系统分别检测跨GEnCs单层膜电阻(TEER)和跨GEnCs异硫氰酸荧光素标记的白蛋白(FITC-BSA)滤过率。
　　 结果：Angptl3可显著增加GEnCs的通透性，且呈剂量效应关系和时间效应关系。(1)Angptl3浓度达到0.1μg/ml始明显降低TEER和增加GEnCs对FITC-BSA的滤过率，分别为TEER降低33.2％(20.32Ω/cm2±4.52Ω/cm2 vs30.42Ω/cm2±1.45Ω/cm2)、FITC-BSA滤过率增加42.5％(0.17±0.045 vs0.12±0.019)(与对照组比较，P<0.01)，Angptl3浓度达到0.5μg/ml时，其对GEnCs的作用达到饱和；(2)0.5μg/ml Angptl3作用GEnCs1h、2h、3h可使TEER分别降低46.9％(16.19Ω/cm2±3.26Ω/cm2 vs30.61Ω/cm2±5.65Ω/cm2)、19.5％(24.81Ω/cm2±2.53Ω/cm2 vs30.82±5.72Ω/cm2)、16.0％(25.76Ω/cm2±2.12Ω./cm2 vs30.6±5.76Ω/cm2)，可使FITC-BSA滤过率分别增加63.6％(0.20±0.032 vs0.12±0.027)、59.7％(0.1±0.056 vs0.16±0.045)、50.9％(0.30±0.089 vs0.2±0.072)(与对照组比较，P<0.01)。
　　 结论：血管生成素样蛋白3能导致肾小球内皮细胞通透性的增加，引起跨肾小球内皮细胞单层膜电阻下降和对FITC-BSA滤过率增加。
　　 第三部分血管生成素样蛋白3调节肾小球内皮细胞通透性机制的研究
　　 目的：探讨血管生成素样蛋白3调节肾小球内皮细胞的信号通路。
　　 方法：(1)肾小球内皮细胞无血清饥饿1小时，再加入血管生成素样蛋白3(0.5μg/ml)或PBS作用1、2、3、4、5、6小时，Western blot检测不同处理时间点磷酸化Akt、总Akt、磷酸化FAK、总FAK、磷酸化ERK、总ERK的表达水平；(2)PI3K/Akt信号通路PI3K特异性抑制剂-LY294002(1μM)或MAPK信号通路的MEK特异性抑制剂-PD89095(1μM)预处理肾小球内皮细胞1小时，再加入血管生成素样蛋白3(0.5μg/ml)共作用1小时，测定肾小球内皮细胞单层膜电阻和对FITC-BSA的滤过率；(3)整合素αvβ3单克隆抑制剂-LM609(1μM)预处理肾小球内皮细胞1小时，再加入血管生成素样蛋白3(0.5μg/ml)共孵育1、3、5小时，Western blot检测磷酸化Akt和总Akt的表达水平；(4)LM609(1μM)预处理肾小球内皮细胞1小时，再加入血管生成素样蛋白3(0.5μg/ml)共孵育1小时，测定肾小球内皮细胞单层膜电阻和对FITC-BSA的滤过率。
　　 结果：(1)Angptl3处理后肾小球内皮细胞磷酸化Akt和磷酸化FAK的表达水平显著增高(与对照组相比，P<0.01)，磷酸化的ERK无明显变化(与对照组比较，P>0.051；(2)PI3K信号通路抑制剂LY294002预处理肾小球内皮细胞1小时能显著抑制Angptl3诱导的肾小球内皮细胞通透性的增高，能使Angptl3引起的跨肾小球内皮细胞的TEER下降减少约71％和对FITC-BSA滤过率的增加下降约76％(与血管生成素样蛋白3处理组比较，P<0.01)，而MAPK信号通路抑制剂PD98059对Angptl3诱导的肾小球内皮细胞的TEER的下降和对FITC-BSA滤过率的增加没有显著抑制作用(与血管生成素样蛋白3处理组比较，P>0.05)；(3)LM609(1μM)预处理肾小球内皮细胞1小时，能显著抑制Angptl3诱导的磷酸化Akt的增高(与血管生成素样蛋白3处理组比较，P<0.01)；(4)LM609(1μM)预处理肾小球内皮细胞1小时，能显著抑制Angptl3诱导的肾小球内皮细胞通透性的增高，能使Angptl3引起的跨GEnCs的TEER下降减少约74％和对FITC-BSA滤过率增加下降约77％(与血管生成素样蛋白3处理组比较，P<0.01)。
　　 结论：血管生成素样蛋白3可能通过整合素αvβ3、FAK/PI3K/Akt信号通路调节肾小球内皮细胞的通透性。
　　 总结
　　 1、血管生成素样蛋白3能显著增加肾小球内皮细胞的通透性，且呈剂量效应关系和时间效应关系；
　　 2、血管生成素样蛋白3可能通过整合素αvβ33、FAK/PI3K/Akt信号通路调节肾小球内皮细胞的通透性。