U937泡沫细胞中组织因子途径抑制物2的表达及变化规律的实验研究

摘要

背景:
　　 动脉粥样硬化疾病已成为威胁国人健康的主要疾病之一,而动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生与局部血栓形成密切相关[1]。组织因子(tissue factor,TF)是血栓形成的起始因子,组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)作为TF的生理抑制剂,它有两种同族异形体,TTPI-1和TTPI-2。大量研究证实TFPI-1在抑制血栓形成和血管重塑等方面发挥重要作用；TFPI-2与粥样斑块的稳定性相关,而它动脉粥样斑块形成阶段的作用尚无相关研究,我们前期动物模型研究初步提示TFPI-2在其中具有一定作用[2]。单核细胞源性的泡沫细胞是粥样斑块早期形成阶段的典型病变,贯穿AS疾病发生发展。我们希望以建立泡沫细胞模型为研究的切入点,初步探讨TFPI-2与AS斑块形成之间的联系。
　　 目的:
　　 1.研究TFPI-2蛋白在U937单核细胞和U937源性泡沫细胞的表达定位；
　　 2.观察氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导U937源性泡沫细胞形成过程中,TFPI-2蛋白表达和基因水平的变化规律；
　　 3.观察外源性hrTFPI-2蛋白干预,对U937源性泡沫细胞胞内胆固醇蓄积的影响,以确定TTPI-2与泡沫细胞形成是否存在联系,并探讨可能的机制和意义；
　　 4.观察泡沫细胞形成中,影响TFPI-2表达的因素。与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)共同培养,U937源性泡沫细胞中TFPI-2蛋白表达和基因水平的变化规律,并探讨该变化可能存在机制及意义。
　　 方法:
　　 1.采用改良沉淀法提取人血浆低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),硫酸铜氧化制备ox-LDL,与U937单核细胞共同孵育,建立泡沫细胞模型。胞内胆固醇定量测定和油红O染色定性评价建模成功。
　　 2.采用双重细胞免疫荧光检测TFPI-2蛋白在泡沫细胞中的表达定位。
　　 3.在ox-LDL诱导U937源性泡沫细胞形成过程中,分设观察时间点收集细胞,采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)半定量分析和荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitativePCR FQ-PCR)相对定量分析TFPI-2基因的动态变化:采用时间免疫分辨荧光(time resolved fluorometric immunoassay,TRFIA)定量检测TFPI-2蛋白表达水平。
　　 4.设rhTFPI-2不同浓度组(1nM,10nM,50nM,100nM,200nM),分别加入含ox-LDL终浓度为80μg/ml,细胞密度为15X104个/ml的U937细胞培液中,共同孵育48h后提取细胞脂质,以脂质测定试剂盒检测,计算胞内胆固醇含量。
　　 5.将HUVEC和U937细胞共同培养,分别用RT-PCR和TRFIA检测TFPI-2基因和蛋白的表达水平。
　　 6.用SPSS10.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差((X)±s)表示,组间比较采用成组t检验分析；P<0.05表明统计学有显著性差异。
　　 结果:
　　 1.泡沫细胞模型的建立和鉴定:
　　 1.1 ox-LDL的制备和鉴定:
　　 分离冠心病患者血浆LDL,经5％琼脂糖电泳证实为单一条带。由硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)值反映LDL氧化程度。新鲜LDL值为3.81±0.53 nM MDA/mg,而ox-LDL的值为31.95±2.93 nMMDA/mg,ox—LDL的TBARS值大于LDL的5倍以上,两者相比有显著统计学差异(P<0.05),提示ox-LDL脂质被有效氧化。同时ox-LDL琼脂糖电泳相对迁移率(relative electrophoresis mobility,REM)升高,亦证实ox-LDL制备成功。
　　 1.2 ox-LDL造模浓度确立和泡沫细胞模型鉴定:
　　 以细胞内胆固醇定量和油红染色定性,作为评价泡沫细胞的指标。不同浓度组的ox-LDL与U937细胞共同孵育48h后,80mg/L ox-LDL组的胞内胆固醇酯/总胆固醇(CE/TC)值大于50％,光镜下观察油红O染色,胞浆内出现大量红染颗粒和脂质空泡；80mg/L LDL组和60mg/L OX-LDL组的CE/TC值均低于50％；120mg/L ox-LDL组的CE/TC值虽大于50％,但凋亡细胞数量显著增多,不利于后续实验；故选择80mg/L ox-LDL与U937细胞(细胞密度15×104个/ml)共孵育48h,确定为最佳建模条件。
　　 2.TFPI-2蛋白在泡沫细胞内的表达定位:
　　 双重细胞免疫荧光证实,TFPI-2蛋白主要定位于U937源性泡沫细胞胞浆,与TF蛋白有类似分布；与正常U937细胞相比较,泡沫细胞中TFPI-2蛋白和TF蛋白的分布情况更趋一致。HUVEC中也存在类似情况,且在氧化损伤情况下,细胞在形态学上的改变,荧光信号强度较正常情况下稍有减弱。
　　 3.泡沫细胞形成过程中TFPI-2蛋白及基因表达的动态变化:
　　 TRFIA检测发现,U937与ox-LDL孵育6h后,TFPI-2蛋白表达量明显增高达峰值；而在共同孵育6h至48h期间,TFPI-2蛋白表达量降低；孵育12h后,TFPI-2蛋白表达量基本低于正常水平。以看家基因β-action为内参,FQ—PCR结果显示,U937与ox-LDL孵育6h,TFPI-2 mRNA表达上调达至峰值；而6h至48h期间TFPI-2 mRNA表达下调。FQ-PCR结果与蛋白水平的变化相一致。
　　 4.外源性TFPI-2蛋白对泡沫细胞胞内胆固醇的影响:
　　 分设rhTFPI-2不同浓度组(1nM,10nM,50nM,100nM,200nM),加入含ox-LDL终浓度为80μg/ml的U937细胞培液中。比较各浓度组与空白组(0nM)之间数据发现:1nM组干预48h后TC和CE/TC水平无明显统计学差异(FC:24.733±1.504 VS23.130±2.341,P>0.1；TC::50.775±2.831 vs52.226±1.662,P>0.1),CE/TC为51.29％；在10nM,50nM,100nM,200nM组干预48h后,各组FC值分别为21.041±1.702、20.911±2.012、20.790±1.127、20.552±2.733；各组TC值分别为38.707±2.011、34.956±2.562、32.118±1.920、32.168±3.023:各组CE/TC值分别为45.64％、40.18％、35.27％、36.11％,各组TC和CE/TC均明显降低,与空白组(0nM)相比有显著统计学差异(P<0.05)。外源性TFPI-2蛋白干预可减少泡沫细胞的胞内胆固醇蓄积,该作用呈一定浓度依赖方式,TFPI-2与泡沫细胞形成存在关联。
　　 5.内皮细胞对泡沫细胞形成中TFPI-2表达的影响:
　　 5.1 ox-LDL对内皮细胞TFPI-2表达的影响:
　　 HUVEC与ox-LOL(80mg/L)共同孵育48h,其TFPI-2蛋白表达量呈先升高后降低的动态改变；共同孵育24h后,其TFPI-2蛋白表达量达峰值。RT-PCR结果显示,在ox-LDL作用24h至48h期间,TFPI-2 mRNA的水平持续增高。提示氧化损伤可能导致内皮细胞TFPI-2蛋白表达障碍。
　　 5.2内皮细胞对泡沫细胞形成过程中TFPI.2蛋白表达的影响:
　　 与单独培养组比较,U937细胞与HUVEC共同培养时TFPI-2的蛋白表达量明显上调；随着ox-LDL氧化损伤时间的延长,尽管共培养组U937细胞的TFPI-2蛋白表达呈下调趋势,但仍高于U937单独培养组。RT-PCR结果显示,U937细胞和HUVEC共同培养48h后,U937细胞TFPI-2 mRNA水平较单独培养组明显上调。
　　 结论:
　　 1.80 mg/L ox-LDL加入细胞密度为15×104个/ml的U937细胞培液中孵育48h,可成功建立U937源性泡沫细胞模型。
　　 2.TFPI-2蛋白主要定位于U937源性泡沫细胞胞浆中,与TF蛋白有相似分布。正常U937细胞中有同样的分布规律,但在泡沫细胞中TFPI-2蛋白和TF蛋白的分布更趋一致。
　　 3.U937源性泡沫细胞形成过程中,早期TFPI-2蛋白和基因水平迅速上调,而后期TFPI-2蛋白和基因水平明显下调,低于正常值水平。在泡沫细胞形成过程中存在TPFI-2蛋白和基因水平的相对缺乏。
　　 4.外源性中高浓度的rhTFPI-2蛋白可改善U937源性泡沫细胞形成过程中胞内胆固醇蓄积,该效应呈一定的浓度依赖方式；低浓度的rhTFPI-2蛋白无此效应,提示TFPI-2与泡沫细胞形成存在联系。
　　 5.与HUVEC共同培养,可以改善U937源性泡沫细胞形成过程中存在的TFPI-2蛋白和基因相对缺乏。