基于磁性材料固定酶的微波酶解新技术

摘要

本文研究了以功能磁性纳米材料固定酶为基础的微波辅助快速酶解新方法。发展了一系列新的在纳米磁性微球表面固定酶的简便方法,并利用纳米磁球能高效吸收微波辐射能量的优点,将蛋白酶固定在合成好的纳米微球上,在微波辐射下,极大的提高了蛋白酶解的效率。相比于传统的溶液酶解方法,该酶解技术将蛋白酶解所需时间从12小时缩短至15秒,而且酶解效果优于传统的溶液酶解方法。在微波辐射的帮助下,甚至连微克级的蛋白也能被有效酶解并鉴定。为了进一步验证该方法的实用性,复杂生物样品----鼠肝全蛋白提取物用该方法在15秒内进行了酶解也显示了非常好的效果。此外,利用一个外加磁铁,固定在磁球上的酶还能被回收利用。本研究分为四个部分：
　　 第一章介绍了选题的背景、意义。介绍了蛋白质组学技术的发展和酶解在这一蓬勃发展领域的重要性和最新技术进展。进而提出,以固定酶为基础的酶解技术已经成为了一个快速或在线酶解的趋势,而微波辅助酶解则因为其简便有效的操作性而受到越来越多的人的关注。二者的结合鲜有报道,也仅局限于标准蛋白。
　　 第二章研究了以四氧化三铁磁球固定酶为基础的微波辅助酶解技术。以γ-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)为偶联剂,只需一步反应就可以将胰蛋白酶固定在磁球上。且四氧化三铁磁球合成简单,磁响应性良好。将这一固定酶与微波辅助酶解技术相结合,所产生肽段用MALDI-TOF MS进行鉴定。结果显示极短时间内标准蛋白就得到了的有效酶解。然后考察不同条件下酶解的完全性和效率。最后将这一微波酶解方法应用到“Top-Down”技术路线中,酶解了鼠肝蛋白提取物的反相分离流份。质谱鉴定结果显示这一方法对实际样品表现出了极好的可行性。
　　 第三章考虑到四氧化三铁磁球表面活性羟基基团少从而导致酶负载量较低的问题,改进了磁性载体。发展了先在四氧化三铁磁球表面包覆硅层,然后再在磁性硅球表面键合GLYMO的方法。通过测定发现酶的负载量提高了3-4倍。类似的用磁性硅球微波酶解标准蛋白,优化反应条件。然后将这一优化之后的条件应用到未经过任何预分离的鼠肝全蛋白。15秒的微波酶解之后,直接进行LC-ESI-MS/MS分析。整个分析过程只有1个小时,在99％可信度下鉴定了318个蛋白,达到了与传统溶液酶解方法相当的效果,但时效性大大增强。这一结果证明了磁性材料微波酶解技术的巨大潜力,它大大增进了蛋白质组学的通量性,并且展示了其在临床诊断应用上的前景。
　　 第四章发展了另一种氨基纳米磁球固定酶的方法,该氨基纳米磁球合成工艺简单,比表面积大,进一步提高了固定酶的量,且克服了磁性硅球合成工艺繁琐,费时费力的缺点。使用氨基纳米磁球后,固定酶的量比之磁性硅球提高了一倍。将其微波酶解技术应用到“shot-gun”分析技术路线中,进一步论证了其在蛋白组学中的实际应用性,并将结果与传统溶液方法作了详细对比。