MnTBAP对小体积肝移植物缺血再灌注损伤保护作用的研究

摘要

第一部分不同方法制作小体积大鼠肝移植模型的比较
　　目的:在对大鼠肝脏移植模型熟练掌握的基础上,根据近年来在“三袖套法”与“二袖套法”在制作模型方面的进展,比较“三袖套法”与“二袖套法”在单人制作模型方面的优缺点,为进一步完成实验研究提供手术成功率高的大鼠模型。
　　方法:利用一些自制简单工具,建立大鼠30％非动脉化大鼠原位肝移植模型。实验分为2组:Ⅰ组:以MiyataM等人的“三袖套法”制作大鼠中叶供肝的30%中叶供肝小体积肝移植组(n=15);Ⅱ组:参照Kamada等人的“二袖套法”制作大鼠30%中叶供肝小肝移植组(n=15)。对Ⅰ、Ⅱ组手术操作时间、受体无肝期、手术成功率、1周存活率及并发症发生率进行分析。
　　结果:Ⅰ组肝上下腔静脉套管失败2例,手术成功率86.6%;Ⅱ组手术成功率100%。Ⅰ、Ⅱ组切取供肝平均时间分别为:Ⅰ组,67.75±7.124min;Ⅱ组,46.00±5.940min;2组间有统计学差异(P<0.05);受体切除肝脏时间:Ⅰ组,36.27±11.074min;Ⅱ组,16.13±1.922min,2组间存在统计学差异(P<0.05)。无肝期时间:Ⅰ组,9.92±2.021min;Ⅱ组15.87±2.588min;2组间存在统计学差异(P<0.05)。Ⅰ组和Ⅱ组大鼠术后1周存活率均达到40%,组间无统计学差别。并发症发生率低,2组间无统计学差异,模型稳定。
　　结论:我们对套管的工具进行了一定的改进,在辅助工具下行“三袖套法”建立大鼠肝移植模型,其肝上下腔静脉套管困难的不足虽然得到一定程度的克服,但仍然有一定的失败率,而且供体修剪时间长,冷缺血时间明显延长。相对而言,“二袖套法”的大鼠肝移植模型冷缺血时间短;无肝期时间虽然比较长,但由于技术的进步,都控制在25分钟内,生存率不低于“三袖套法”建立的大鼠肝移植模型。“二袖套法”技术要求稍低,更容易掌握,训练时间不是太长,手术成功率高。熟练掌握大鼠肝移植技术,改进套管方法,并注重所有手术细节的处理,单人采用“二袖套法”建立稳定可靠的大鼠肝移植模型,更具可行性。
　　第二部分MnTBAP对不同体积肝移植大鼠术后肝细胞存活的影响 目的:探讨MnTBAP对SD大鼠不同体积肝移植术后肝细胞存活的影响及其机制。
　　方法:参照Kamada等人的“二袖套法”建立不同体积SD大鼠原位肝移植模型,实验分为四组,60%体积肝移植组(A组)、45%体积肝移植组(B组)、30%体积肝移植组(C组)和假手术组(D组)。前3组又分为单纯移植组和MnTBAP治疗组。比较拟于术后3h处死的各组大鼠,在断流前及门静脉再灌注后即刻、15分钟、30分钟门静脉压力变化;收集受体再灌注后3h、6h、12h和24h、48h外周血查ALT变化、肝脏中核转录因子-κB(NF-κB)及其抑制物I-κB、肿瘤坏死因子—a(TNF-a)的表达、丙二醛(malondialdehvde,MDA)、与肝细胞损伤间的关系。病理学检查肝细胞坏死及凋亡的变化情况、并观察术后7天生存率。
　　结果:大鼠肝移植术后门脉复流早期,门静脉的压力在30%小肝组较45%及60%肝移植组明显升高(即刻、15min,P<0.05);并且45%小肝组门静脉压力也高于60%肝移植组,但统计学并无差异(P>0.05)。各移植组肝组织NF-κB的活性在复流后3、6、12h明显升高(P<0.05);TNF-a及MDA含量在6、12、24h显著升高(P<0.05),血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性亦显著升高(P<0.05),ALT水平在小肝组明显高于60%肝移植组(P<0.05),两个小肝组之间无差别(P>0.05)。病理显示组织损伤、肝血窦扩张在小移植物组较60%肝移植组细胞损伤变化更重(P<0.05);I-κB在3、6、12h的表达均下降(P<0.05)。与同组中单纯移植组比较,各组中经MnTBAP治疗组的门静脉压力较单纯移植组无明显变化(P>0.05),但各组中经MnTBAP治疗组的血清ALT水平(P<0.01)、NF-κB的活性(P<0.05)、肝组织TNF-a的表达均有显著下降(P<0.05),且MDA含量明显降低(P<0.05)。病理检查显示:肝细胞损伤变化减轻。
　　结论:肝移植术后,门静脉的压力与移植物体积大小密切相关。ROS的生成与门静脉的压力、肝损伤的程度密切相关。MnTBAP不能降低门静脉压力,但是对ROS的生成有明显抑制作用,减轻了ROS促进损伤性细胞因子表达的作用,减轻了移植肝的I/R损伤。
　　第三部分MnTBAP对大鼠不同体积肝移植术后肝再生的影响
　　目的:研究MnTBAP对不同体积大鼠小肝移植物模型肝再生的作用及机制。
　　方法:参照Kamada等人的“二袖套法”建立不同体积SD大鼠原位肝移植模型,实验分为6组,60%体积肝移植组,A组(n=30);45%体积肝移植组,B组(n=30);30%体积肝移植组,C组(n=30);经MnTBAP治疗的60%体积肝移植组,D组(n=30);经MnTBAP治疗的45%体积肝移植组,E组(n=30);经MnTBAP治疗的30%体积肝移植组,F组(n=30)。比较受体再灌注后3h、6h、12h和24h、48h外周血查ALT变化、肿瘤坏死因子—a(TNF-a)、IL-6水平的表达;检测不同时间段移植物损伤、肝细胞增殖、相关的细胞周期蛋白的表达、TNF-a/IL-6/Stat3通路的激活情况及相互关系。病理学检查肝细胞再生的变化情况、并观察术后7天生存率。
　　结果:SD大鼠肝移植后移植物内TNF-a、IL-6水平迅速升高,分别于术后6～12h达高峰。与A组比较,B、C组移植物内TNF-a、IL-6水平显著升高(P<0.01),且C组高于B组,但B、C组间并无统计学差异(P>0.05);复流后6、12、24h,移植物内TNF-a、IL-6水平在各MnTBAP治疗组的表达与同体积单纯肝移植组比较,均存在统计学差异(P<0.05),但TNF-a、IL-6水平在各MnTBAP治疗组的表达仍维持较高水平。与同体积单纯肝移植组比较,Stat3/PStat3、细胞周期蛋白cyclinD1表达、PCNA阳性细胞比率在D、E组的结果均无统计学差异(P>0.05)。但与同体积30%单纯肝移植组比较,Stat3/PStat3、细胞周期蛋白cyclinD1表达、PCNA阳性细胞比率在F组的结果却存在统计学差异(P<0.05)。总体上,MnTBAP治疗组与单纯肝移植组比较,其术后7天生存率存在统计学差别(P<0.05)。
　　结论:由于多种因素影响,30%肝移植组肝脏再生能力在复流后早期受损:MnTBAP治疗可以降低小移植物肝组织损伤程度,对肝细胞再生有良好的保护作用,可能与维持TNF-a介导的stat3/Pstat3通路的稳定有关。

目录

缩略词

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正文

第一部分 不同方法制作小体积大鼠肝移植模型的比较

第二部分 MnTBAP对大鼠不同体积肝移植术后肝细胞损伤的影响

第三部分 缺血预处理对大鼠小体积肝移植术后肝再生的影响

综述1 大鼠原位肝移植模型的发展与比较

综述2 自由基的细胞毒性和超氧化物歧化酶及其模拟物的研究进展

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